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MicroRNA,是一种含有22 nt核苷酸,非蛋白质编码的小分子RNA,能与mRNA的3’UTR(3’非编码区)联系来调控基因的表达。尽管现在研究知道有多个小分子RNA可在血管生成期间调节基因表达,但其在血管生成期间的各种作用还没有完全研究透彻。基于此,本课题研究了miR-29C通过胰岛素样生长因子1在调节血管内皮细胞的细胞周期和血管生成基因表型的作用。结果表明,IGF-1在人脐静脉内皮细胞(]3UVECs)中有高表达并被miR-29c下调。与此研究结果一致的是,在引入外源性的miR-29C或miR-29C抑制剂可相应改变HUVEC的细胞周期、增殖和血管形成。此外,通过荧光素酶报告试验,我们发现,IGF-1作为miR-29C抑制基因的转录因子,其表达由miR-29c通过3’-UTR直接调控。由此,我们得出结论,miR-29C在调节细胞周期、细胞增殖和内皮细胞形成血管过程中发挥重要作用。这个功能可能是通过蛋白质IGF-1在转录后水平介导的。作为一种新型的靶分子,miR-29c在与血管发生相关的疾病的治疗中具有潜在的价值,例如心血管疾病和癌症。第一部分 miR-29c对血管形成相关转录因子表达的影响目的：探讨miR-29c对血管形成相关转录因子表达的影响。方法：培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),并构建miR-29C mimics和miR-29C inhibitor转染。通过Real-time PCR检测miRNA转染后相关因子mRNA的表达,Western Blot检测miR NA转染后相关因子蛋白的表达,免疫荧光检测VEGF表达。结果：人脐静脉内皮细胞转染miR-29c模拟物造成PI3K, AKT和VEGFmRNA和蛋白表达水平的显著下降(P<0.01),但IGF-1仅表现为蛋白水平下降, mRNA表达却无明显改变(P>0.05)。免疫荧光细胞组化检测结果显示,人脐静脉内皮细胞转染miR-29c模拟物能明显抑制VEGF表达(P<0.05),而转染miR-29c抑制剂组VEGF表达增强(P<0.05)。结论：miR-29c能够抑制血管形成相关转录因子PI3K、AK T和VEGF的mRNA蛋白表达。同时,miR-29c能下调IGF-1的蛋白表达,但不影响其mRNA表达,提示其对IGF-1的作用为转录后调节,即翻译抑制。第二部分miR-29c对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响目的：探讨miR-29c对人脐静脉内皮细胞增殖活性、迁移能力及血管形成能力的影响。方法：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养并转染。通过MTT、EdU检测转染对细胞增殖能力影响,流式细胞分析术检测细胞周期变化,Transwell检测细胞的迁移能力变化,小管形成实验检测细胞的血管形成能力变化。结果：在人脐静脉内皮细胞转染miR-29c模拟物组,]HUVECs和293-T细胞的增殖率分别下降了57.6%和36.3%,与空白组对照有显著性差异(P<0.05)；转染miR-29c模拟物组与其余组比较,DNA合成S期的细胞数量最少,进入G2期的细胞数量最多,HUVECs增殖活性明显下降,]HUVECs迁徙能力明显减弱,较空白对照组下降了31%,较转染miR-29c抑制剂组下降64%；细胞血管生成能力显著下降,生成血管的直径较小且成环率降低(P<0.05)。转染miR-29c抑制剂组与其余组比较,DNA合成S期的细胞数量最多,]HUVECs增殖活性明显增强, HUVECs迁徙能力明显增强,细胞血管生成能力也有加强(P<0.05)。结论：miR-29c能抑制HUVECs的增殖活性、细胞移行及血管形成,这可能由于miR-29c的表达对内皮细胞生长因子的信号通路有影响,进而影响了细胞的生物学行为。第三部分miR-29c抑制人脐静脉内皮细胞血管生成的分子机制研究目的：探讨miR-29c抑制血管形成能力的机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后进行niRNA靶向基因的生物学预测。通过构建IGF-1 3’UTR端荧光素酶质粒后进行荧光素酶报告基因检测及细胞划痕实验研究miR-29c印制人脐静脉内皮细胞血管生成的分子机制。结果：miR-29c模拟物能明显降低IGF-1 3’UTR萤光素酶报告基因的荧光强度(P<0.05)；但是却不能降低IGF-1 3’UTR突变组萤光素酶报告基因的荧光强度(P>0.05)。当加入miR-29c抑制物后,IGF-1 3’UTR萤光素酶报告基因的荧光强度明显增加(P<0.05),但突变较对照组没有明显变化(P>0.05)。细胞划痕24h后,转染miRNA-29c mimics的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组划痕愈合的速度明显弱于转染miRNA-29c inhibitor的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) (P<0.01,图3.3、3.4)；当转染miRNA-29c mimics的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)加入IGF-1后,划痕愈合的速度明显增加(P<0.05),提示IGF-1拯救了miRNA-29c导致的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁徙能力降低的现象。结论：IGF-1/PI3K/AKT/VEGF途径可以调节血管的生成,miRNA-29C通过靶向结合在IGF-1的3’UTR端,从而抑制IGF-1在翻译水平的表达。IGF-1的表达抑制下调了下游通路的相关基因如PI3K、AKTVEGF的表达,最终抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的成血管能力。