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激活素A(Activin A)属于转化生长因子(transforming growth factor beta,TGFβ)超家族的重要成员,在乳腺癌患者的组织及炎症活化的中性粒细胞中均有高表达。然而,Activin A对乳腺癌细胞和中性粒细胞迁移的影响及其机制仍缺乏深入的研究。微流控(Microfluidics)指的是使用微管道处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术,微流体装置通常被称为微流控芯片,也被称为芯片实验室(Lab on a Chip),利用仿生微结构和水凝胶等生物材料,微流控芯片非常适合在体外实现组织和器官水平的生理功能,亦被称为"器官芯片"(Organs-on-Chips)。这样可以弥补传统二维细胞培养和动物实验的不足,可以动态操控和实时观察重要的生理病理过程。因此,本研究中我们应用新的三通道微流体芯片分析了激活素A对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞及中性粒细胞迁移,以及乳腺癌细胞培养上清对中性粒细胞迁移的影响。1.Activin A促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞迁移本研究应用三通道微流控芯片检测Activin A对MDA-MB-231细胞迁移的影响。实验设表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)为阳性对照,研究结果显示Activin A与EGF具有相似的促进MDA-MB-231细胞迁移作用,其作用具有剂量依赖性。研究同时采用RT-PCR与Western blot检测了表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase 1/2,ERK1/2)在MDA-MB-231细胞的表达。RT-PCR结果显示,Activin A和EGF均能上调EGFR m RNA表达。Western blot结果显示,Activin A和EGF均能促进MDA-MB-231细胞中ERK1/2表达,并上调磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白水平。研究进一步通过流式细胞术检测MDA-MB-231细胞胞内钙离子浓度变化,结果显示,Activin A作用后,MDA-MB-231细胞胞内的钙离子水平明显增加。2.Activin A抑制f MLP诱导的人中性粒细胞迁移本研究进一步应用三通道微流体芯片探讨Activin A对人中性粒细胞迁移的影响。实验设N-Formyl-Met-Leu-Phe(f MLP)为阳性对照,采用细胞趋化性指数(chemotaxic index,CI)和细胞迁移距离评价细胞迁移情况。研究结果显示f MLP能诱导人中性粒细胞趋化迁移,然而Activin A单独应用不能诱导中性粒细胞迁移。但有趣的是,Activin A能抑制f MLP诱导的中性粒细胞迁移。此外,我们将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)加入微流体芯片通道中并使其排列在对接结构上,并在培养液中生长2~4h以更好的模拟血管内皮层,然后检测Activin A对中性粒细胞跨HUVEC层迁移的影响。结果表明Activin A能够降低中性粒细胞跨HUVEC层的迁移能力。同时,流式细胞术结果显示Activin A能够降低由f MLP刺激的人中性粒细胞胞内钙离子浓度。3.Activin A促进MDA-MB-231细胞诱导中性粒细胞迁移有研究表明中性粒细胞能够促进癌细胞的转移,尤其是转移的起始过程。同时肿瘤细胞也能够通过分泌趋化因子招募中性粒细胞至肿瘤微环境。因此,研究进一步应用三通道微流体芯片研究Activin A对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞诱导中性粒细胞迁移的影响。实验采用Activin A刺激体外培养MDA-MB-231细胞24h,收集细胞培养上清,加入到微流体芯片中,观察肿瘤细胞培养上清诱导中性粒细胞迁移速度和趋化性。结果显示,与培养液对照组相比,未用Activin A处理的MDA-MB-231细胞培养上清液具有诱导中性粒细胞趋化迁移的作用,而Activin A处理的MDA-MB-231细胞培养上清液与未用Activin A处理的MDA-MB-231细胞培养上清液组相比,中性粒细胞趋化性及迁移速度均明显提高。综上所述,Activin A能促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞迁移,其作用与EGFR-ERK信号途径相关,也与Activin A调控细胞内钙离子浓度有关。另外,虽然Activin A并不影响人中性粒细胞的运动能力,但却能抑制f MLP诱导的中性粒细胞趋化迁移及跨HUVEC层迁移能力,其作用与细胞内钙离子浓度变化有关。研究也进一步证实Activin A对不同组织来源细胞具有不同的生物学效应,但其相关信号传导机制仍有待研究。另外,研究中我们尝试应用新型微流体芯片实现了细胞对接功能研究,可有效进行实时监测细胞的动态迁移及穿透血管壁屏障过程,实现在单细胞水平的定量细胞趋化迁移研究。肿瘤培养上清对中性粒细胞趋化研究,也为进一步阐明肿瘤微环境与中性粒细胞之间的作用提供了新的研究基础,为临床肿瘤研究和干预提供了新的思路和方案。