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研究目的1.构建体内博来霉素肺纤维化大鼠模型,研究康复新液抗肺纤维化作用;2.构建体外肺纤维化细胞模型,研究康复新液对小鼠肺成纤维细胞增殖和迁移影响;3.观察康复新液对细胞周期蛋白Cyclin D1和CKIS的影响,研究康复新液抗肺纤维化作用机制,以期为康复新液用于治疗肺纤维化提供实验室依据。实验方法选择SD大鼠为体内研究对象,使用博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型。给予康复新液灌胃治疗后,观察大鼠体质量、肺湿重和肺系数等一般体征变化;H&E染色法观察肺组织病理变化;Masson染色法观察胶原沉积;Ashcroft评分评价纤维化程度;免疫组织化学法观察各组大鼠肺组织内α-SMA、MMP 1、MMP3、MMP9、TIMP-1、Collagen I、Collagen III表达。选取小鼠肺成纤维细胞为体外研究对象,分离细胞后使用差速贴壁法纯化细胞,免疫细胞化学法鉴定细胞。CCK8检测小鼠肺成纤维细胞活力;细胞计数法检测小鼠肺成纤维细胞增殖;Transwell法检测小鼠肺成纤维细胞迁移;RT-PCR法检测小鼠肺成纤维细胞Cyclin D1、p15ink4b、p18ink4c、p19arf基因mRNA水平。实验结果1.康复新液抗肺纤维化作用评价:(1)一般体征:与模型组比较,康复新液各剂量治疗组肺系数分别增加38.8%(P<0.01),26.7%(P<0.01),12.9%(P<0.05)降低。(2)肺组织病理学:H&E染色结果显示,模型组大鼠肺组织受损严重,大量肺泡塌陷后形成纤维化瘢痕并伴随弥漫性胶原纤维增生,肺泡壁明显增厚,肺泡数量减少,康复新液各剂量治疗组和地塞米松组减轻了上述病变;改良Ashcroft评分统计结果显示,与博来霉素组比较,康复新液各剂量治疗组Ashcroft评分降低64.7%(P<0.01),37.5%(P<0.01),20.8%(P<0.05);Masson染色结果显示,与博来霉素组比较,复新液各剂量治疗组和地塞米松组大鼠肺组织内胶原含量明显减少。(3)肺纤维化肺组织相关生物学指标:免疫组化结果显示,与模型对照组比较,康复新液各剂量治疗组大鼠肺组织α-SMA、MMP1、MMP3、MMP9、TIMP-1、Collagen I和Collagen III蛋白的表达明显降低;2.复新液对小鼠成纤维细胞影响:(1)细胞增殖:CCK8结果显示,康复新液以浓度依赖方式抑制成纤维细胞活力;细胞计数法结果显示,康复新液组减少了TGF-β1诱导后成纤维细胞在不同时段的细胞数量。(2)细胞迁移:Transwell结果显示,康复新液组减少了TGF-β1诱导后迁移细胞数量。3.康复新液对成纤维细胞作用机制:RT-PCR结果显示,康复新液组降低了成纤维细胞Cyclin D1、p15ink4b、p18ink4c、p19arf基因表达水平。结论1.康复新液可以改善BLM诱导肺纤维化大鼠一般体征和肺组织损伤,在肺纤维化中发挥一定保护作用;2.康复新液可以减少肺BLM诱导肺纤维化模型大鼠肺组织胶原产生和肺泡结构损伤,并降低肺纤维化生物学指标MMP1、MMP3、MMP9、TIMP-1、α-SMA、Collagen I、Collagen III的表达,具有抗肺纤维化作用;3.康复新液可以抑制TGF-β1刺激后肺成纤维细胞增殖,减少肺纤维化成纤维细胞数量;4.康复新液可以抑制TGF-β1刺激后肺成纤维细胞迁移,减少肺纤维化成纤维细胞聚集;5.康复新液可能通过抑制细胞周期蛋白Cyclin D1表达和促进CKIS的表达从而抑制成纤维细胞增殖而发挥抗肺纤维作用。