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目的:探讨不同浓度富血小板血浆(PRP)对体外培养的人牙髓细胞(HDPCs)增殖及矿化作用的影响。
方法:⑴HDPCs培养及鉴定:牙髓细胞来源于临床因正畸或阻生而拔除的健康年轻恒牙,采用组织块法进行原代培养,并计算组织块法培养成功率;观察HDPCs的生长情况及细胞形态;细胞波形丝蛋白(Vimentin)及角蛋白(CK)免疫组化染色鉴定细胞来源;绘制细胞生长曲线,测定细胞倍增时间;体外连续培养HDPCs 30d后Von Kossa染色观察细胞形成钙结节能力。⑵PRP制备及细胞增殖检测:两步离心法制备PRP,血常规分析仪检测全血及PRP中血小板浓度,ELISA方法测定全血及PRP中血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度;采用四唑盐比色法(MTT)观察不同浓度的PRP培养HDPCs 2d和4d后细胞的增殖情况。⑶细胞矿化能力检测:分组培养HDPCs 3d和6d后测定牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;采用电化学发光法检测细胞培养8d,12d和16d后上清液骨钙素(OCN)的含量;连续培养HDPCs 30d后,采用茜素红染色的方法来观察各组细胞形成矿化结节能力,并利用Photoshop软件测定各组钙化结节的面积。
结果:①本实验组织块法培养原代细胞成功率为40%;免疫组化染色显示 Vimentin染色阳性,CK染色为阴性,提示细胞来源于中胚层;体外培养的人牙髓细胞增殖较快,细胞倍增时间为44.42h,连续培养HDPCs 30d后细胞能形成矿化结节,Vonkossa染色呈阳性。②两步离心法制备的PRP中血小板的浓度大于1000×109个/L,为全血中的4倍以上,经ELISA的方法测定PRP中PDGF-AB和TGF-β1的浓度亦为全血的4倍以上。MTT法测定不同浓度组的PRP对HDPCs均有促进增殖作用,以10%PRP增殖效应最明显,4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时,10%PRP组较10%胎牛血清组增殖作用明显。③加入不同浓度的PRP培养HDPCs 3d和6d后,牙髓细胞ALP活性明显降低,P<0.05;在DMEM中加入10%PRP培养8d,12d及16d后,细胞OCN浓度与DMEM组相比差异无显著性,而在10%FBS中加入10%PRP培养8d、12d及16d后OCN含量明显下降,P<0.05;实验组中加入10%PRP连续培养30d后,与对照组(10%FBS)相比矿化结节面积减小,差异具有显著性。
结论:本实验体外培养的HDPCs具有较好的体外增殖及形成矿化结节的能力;两步离心法制备的PRP含有较高浓度的PDGF-AB及TGF-β1,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖,以10%PRP浓度增殖效应最明显;PRP能抑制牙髓细胞矿化。