论文部分内容阅读
脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究，但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株，以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术的原理，利用PCR扩增B29的waaL和waaG基因上下游同源臂，并与广宿主自杀性质粒构建敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG，将敲除载体电击转入E.coli SM10菌株并使其与B29菌株共同培养，再经过抗生素和蔗糖培养筛选waaL和waaG基因缺失突变株，并利用多重PCR、ERIC-PCR、PCR-DGGE、DNA测序对突变株进行验证。用生物学功能实验比较野生株与突变株在脂多糖结构、内毒素活性、生长速率等方面的差异。多重PCR、ERIC-PCR、PCR-DGGE、DNA测序结果证实waaL和waaG基因的敲除突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功，银染实验结果表明B29菌株的脂多糖为光滑型结构，而突变株的LPS分子量大小要明显小于野生型菌株，尤其是B29△waaG突变株；而基质显色鲎试剂法（LAL）检测LPS的内毒素活性发现，突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降；生长曲线测定结果表明B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当，而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。构建了LPS结构改变、内毒素活性下降的阴沟肠杆菌B29菌株的突变株B29△waaL和B29△waaG，为进一步研究该菌株的LPS在人或无菌小鼠的肥胖和胰岛素抵抗的发生过程中所起作用奠定了基础。