背景与目的组胺(Histamine, HA)是人体内重要的自体活性物质,具有广泛的生理作用,同时也参与介导多种疾病的病理生理过程。在中枢神经系统,存在完整的HA能神经体系,HA作为中枢神经递质参与介导认知记忆、睡眠觉醒、饮水摄食等功能。在外周组织中,HA主要以肥大细胞源和非肥大细胞源两种形式贮存。肥大细胞来源的HA参与介导变态反应的病理过程,非肥大细胞源性HA的生理和病理作用尚不十分清楚。业已发现,非肥大细胞来源的HA存在于大鼠外周胃肠道的神经、颈上神经节(Superior cervical ganglion, SCG)、颈动脉体感觉神经元等,提示HA可能与这些神经元的活动有关。我们以往的研究发现,在豚鼠SCG的神经元内,参与合成HA的组胺酸脱羧酶(Histidine decarboxylase, HDC)与合成去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)的酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)和多巴胺β羟化酶(Dobamine-β-hydroxylase, DβH)共存,而且HA和NE也共存其中;刺激交感神经末梢能使HA和NE从交感神经末梢共释放;激动交感神经末梢突触前膜HA H3受体能够负反馈调控HA和NE的释放。根据以上研究结果,我们首先提出HA很可能是一种尚未被认识的新的交感神经递质,并提出HA参与负反馈调控交感神经传递的假说。然而HA与NE在交感神经元内的共存是否具有普遍性?HA在交感神经元内的亚细胞定位如何?HA从交感神经元内释放是否遵循经典神经递质囊泡释放的规律?这些都是为最终定义HA作为一种新的交感神经递质所必须回答的问题。基于以上问题,本研究采用免疫荧光多重标记、顺行示踪及激光共聚焦显微镜技术,观察HA在不同种属动物交感神经节与交感神经末梢的分布,及其与NE的共存;采用包埋前免疫电镜技术观察HA在交感神经末梢和培养交感神经节细胞的亚细胞定位;在新生豚鼠原代培养SCG细胞上,利用FM1-43荧光染料研究HA突触囊泡释放、运动的循环动力学,为最终证实HA是一种新的交感神经递质提供新证据。开展这一领域的研究对于揭示交感神经的新功能,深入认识交感神经功能紊乱疾病相关疾病的发病机理,寻找新的具有潜在治疗可能性的药物新靶点等都具有重要的理论意义。结果1.组胺和NE在不同动物交感神经系统的共存分布本研究采用免疫荧光双标和激光共聚焦显微镜技术,发现在小鼠SCG、狗SCG和腹腔交感神经节神经元内,以及小鼠和豚鼠输精管、肠系膜动脉的交感神经神经末梢中均有HA和NE共存。在小鼠和狗的SCG中,NE样免疫阳性神经元中HA的双标率分别为70%和40%,狗腹腔节中NE样免疫阳性神经元中HA的双标率为60%。在小鼠和豚鼠的输精管、肠系膜动脉标本上,NE样免疫阳性神经纤维中HA的双标率分别为80%和30%。在豚鼠SCG局部微量注射顺行示踪剂生物素化葡聚糖胺(Biotinylated dextranamine, BDA),取豚鼠心脏标本,采用免疫荧光三重标记技术观察自SCG投射到心脏的交感神经纤维和末梢中HA。结果显示,BDA顺行示踪投射到心脏的交感神经纤维中,20%的示踪神经纤维呈HA样免疫阳性反应,10%示踪神经纤维呈现HA和NE样免疫阳性反应。上述结果在细胞水平确定HA广泛分布于不同种属动物的交感神经系统内,并与NE共存,为定义HA作为新的交感神经递质提供了直接的形态学证据。2.组胺在交感神经末梢及培养SCG神经元中的亚细胞定位在支配豚鼠输精管交感神经末梢内,以及原代培养的豚鼠SCG神经元内,利用HA包埋前免疫电镜技术,电镜观察显示,HA样免疫阳性物质定位于直径约50 nm的小囊泡内,且HA阳性囊泡约占囊泡总数的90%以上,大囊泡(直径>100 nm)及个别小囊泡无HA免疫阳性物质。结果表明,交感神经元内HA主要存在于小囊泡中,本项结果在亚细胞水平为定义HA作为新的交感神经递质提供了直接的形态学证据。3.培养SCG神经突起部位组胺突触囊泡循环动力学利用FM1-43荧光染料,结合HA免疫荧光染色,在培养豚鼠SCG神经元突起上观察HA囊泡的释放动力学和HA囊泡的运动过程,激光共聚焦显微镜成像并统计分析结果。脱色(Destaining)研究结果显示,SCG神经突起中HA的红色荧光信号强度与FM1-43绿色荧光信号强度随除极刺激作用时间的增加,而呈现同时逐渐减弱的现象,两者呈显著正相关(r = 0.989, P < 0.01),表明HA的释放遵循囊泡释放动力学的普遍规律。在除极作用的不同时间点固定细胞,分别测定代表HA的红色荧光强度和代表FM1-43的绿色荧光强度,结果表明HA的红色荧光强度要强于FM1-43的绿色荧光强度。由于在本研究采用的除极条件下,FM1-43荧光信号主要反映循环囊泡的释放情况,HA与FM1-43的荧光强度出现差异的结果提示,在神经突起部位贮存HA的囊泡可能存在可释放囊泡库和储备囊泡库之分。荧光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)结合免疫组织化学研究结果显示,在SCG神经突起处含有HA囊泡的扩散速度为0.09μm2/s,其他囊泡为0.08μm2/s。HA囊泡的运动过程与其他囊泡无显著性差异。结论:1. HA普遍存在于多种动物的交感神经系统,并与经典交感神经递质NE共存。2. HA主要贮存于交感神经突触小囊泡内。3.交感神经元内HA囊泡的释放遵循经典递质囊泡循环动力学规律,贮存HA的囊泡可能存在可释放囊泡库和储备囊泡库之分。