【摘 要】
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目的:毛冬青在临床上广泛应用于心血管疾病,疗效确切,毛冬青三萜皂苷（IPTS）是毛冬青的主要药效成分。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）作为多数心血管疾病产生的原因,炎性因子浸润血管内皮细胞（HUVEC）所引起的细胞炎性损伤及细胞凋亡在AS的发生发展中具有重要作用。本项目拟将HUVEC看作一个微观的有机整体,整合先进的分析技术和细胞分子生物学技术,研究毛冬青IPTS多组分在血管内
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目的:毛冬青在临床上广泛应用于心血管疾病,疗效确切,毛冬青三萜皂苷（IPTS）是毛冬青的主要药效成分。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）作为多数心血管疾病产生的原因,炎性因子浸润血管内皮细胞（HUVEC）所引起的细胞炎性损伤及细胞凋亡在AS的发生发展中具有重要作用。本项目拟将HUVEC看作一个微观的有机整体,整合先进的分析技术和细胞分子生物学技术,研究毛冬青IPTS多组分在血管内皮细胞内的摄取转运过程及规律,抗血管内皮细胞炎性损伤和细胞凋亡的药理效应以及基于PI3K/AKT-自噬的药效作用机制,期望在细胞及分子水平为中药及其制剂对AS引起的心血管疾病的防治带来新的启示并提供新策略。方法:1.IPTS在HUVEC中的吸收及转运机制采用UPLC-qTOF-MS/MS定性分析IPTS的入胞成分,建立LC-QQQ-MS/MS方法定量分析IPTS成分冬青素A（C1）及毛冬青皂苷B1（C3）在HUVEC细胞内的吸收特点和跨膜转运机制。2.1PTS对血管内皮细胞炎性损伤和凋亡的影响构建TNF-α诱导HUVEC细胞炎性损伤模型,并用IPTS对模型细胞进行干预治疗,通过对细胞活性、凋亡率、线粒体膜电位（JC-1）、相关凋亡蛋白的表达（Caspase-3,Caspase-9）、相关炎性蛋白（ICAM-1，MMP-9）的表达等指标的检测,评价IPTS对炎性模型细胞的药效作用。3.PI3K/AKT-自噬在IPTS抑制内皮细胞炎性损伤及凋亡中的作用研究通过使用自噬激活剂白藜芦醇（RSV）和抑制剂3-MA,PI3K/AKT信号通路激活剂IGF1和抑制剂LY294002分别共同作用于IPTS干预下的TNF-α诱导的HUVEC细胞,通过检测相关炎性蛋白（ICAM-1,MMP-9,MCP-1）和相关凋亡蛋白的表达（Caspase-3,Caspase-9）、凋亡率、线粒体膜电位（JC-1）等指标,探讨在IPTS抑制内皮细胞炎性损伤及凋亡中,自噬及PI3K/AKT信号通路在其中的关键作用。结果:1.IPTS的12个成分中可以被HUVEC细胞吸收9个成分,其中含有7个三萜皂苷类成分;IPTS的成分冬青素A（C1）和毛冬青皂苷B1（C3）在细胞内的吸收呈时间、温度、浓度依赖,两种成分的吸收均具有双峰现象,而且在6h后可达到平衡;C1/C3两种成分的摄取转运均有被动扩散和主动运输两种形式,其中载体蛋白SGLT1可能介导了C1/C3的跨膜转运过程,而且维拉帕米可以显著提高C1/C3在细胞内的蓄积;2.建立TNF-α诱导的HUVEC炎性损伤和凋亡模型;与模型组相比,IPTS可以显著改善HUVEC的细胞形态损伤,提高细胞活性,减少炎症相关蛋白ICAM-1,MMP-9的表达从而达到抗炎作用,并且显著抑制了细胞凋亡,还可以减少线粒体膜电位的降低和细胞核浓染,可以有效预防和改善HUVEC炎性损伤和细胞凋亡;3.IPTS可以显著激活模型细胞自噬,且自噬在IPTS抑制TNF-α诱导的HUVEC细胞炎性损伤和凋亡具有重要的作用;IPTS可以显著抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,PI3K/AKT/mTOR信号通路部分参与了调控自噬改善抑制TNF-α诱导的HUVEC细胞炎性损伤和凋亡,但是对调控IPTS通过自噬改善模型细胞炎性损伤和凋亡的作用机制尚证据不足。结论:1.本课题通过定性及定量分别分析了 IPTS在HUVEC细胞中的吸收成分及成分吸收规律和跨膜转运机制,证明了 IPTS可以特异性被血管组织及细胞吸收,且可以在血管细胞中持久分布。2.利用TNF-α诱导的HUVEC细胞炎性损伤和凋亡模型作为研究对象,考察了IPTS对模型细胞炎症损伤和凋亡的改善,并且通过自噬的角度解释了 IPTS抑制模型细胞炎症和凋亡的作用机制。3.从PI3K/AKT信号通路对调控IPTS通过自噬改善模型细胞炎性损伤和凋亡的作用机制尚证据不足,因此是否有其它信号通路参与调控自噬而对IPTS抑制TNF-α诱导的HUVEC细胞炎性损伤和凋亡中起到作用还需要进一步的探究。
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