脂肪酶是医药、化工、食品和化妆品领域的重要原料,是生物技术及有机合成方面应用最广泛的一类酶。根霉属(Rhizopus sp.)微生物是脂肪酶的重要生产菌。根霉脂肪酶大多具有高度的1,3位置专一性,在油脂加工和多种有机化合物的制备中以其较好的立体选择性等优点受到了关注。根霉菌丝体的存在对于根霉属脂肪酶产物的分离和纯化造成了极大的阻碍,所以我们考虑选择外分泌型表达宿主克隆表达根霉属脂肪酶基因。枯草杆菌是一种非致病性微生物,对人畜无害,具有完备的分泌系统,能将外源基因表达产物分泌至细胞外,有利于外源产物的纯化与回收,因此选择枯草杆菌作为表达宿主。本文克隆了Rhizopus arrhizus L-03-R-1的脂肪酶基因ral,构建了重组表达载体pGJ103-P43-SP-ral,在枯草芽孢杆菌表达体系中进行了ral基因的组成型分泌表达研究。首先,以少根根霉基因组为模板PCR扩增得到800kb的目的基因片段,经TA克隆转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子进行验证及序列测定,测定结果与报道完全一致。ral基因片段经过酶切处理后,与P43-SP启动子信号肽基因连接,构建成P43-SP-ral基因表达盒,该表达盒经过双酶切后插入到pGJ103质粒中,成功构建了ral基因的枯草杆菌组成型表达体系。然后,由SDS-PAGE鉴定表明,目的蛋白在胞内有表达,而胞外基本没有表达。通过橄榄油琼脂板透明圈法与橄榄油乳化液滴定法鉴定、检测外源脂肪酶蛋白的表达效果,发现仅在胞内具有1.5U/ml左右的酶活。以考马斯亮蓝法测定胞内外蛋白含量,结果表明:胞外有微量目的蛋白表达,但因浓度过低,不能产生酶活力;同时发现,胞内蛋白量以及酶活性并没因随宿主菌培养时间的增加而获得相应的提高,其蛋白含量和酶活力在6-12小时内保持一定水平,12小时以后蛋白含量和酶活有降低的趋势。