烧伤是以皮肤损伤为始发因素的特殊类型创伤,其主要问题是创面问题,如何尽早封闭、修复创面是烧伤治疗的根本任务。创面愈合一直是医学研究的重要领域,但讫今包括浅度烧伤创面在内的创面愈合机理并不完全清楚。研究表明,创面的封闭主要依赖于残存、健在的皮肤表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)增殖、分化,并最终修复创面,尤其是来自于毛囊外鞘隆突部(bulge)的表皮干细胞在其中起着十分重要的作用。仅当表皮干细胞离开其固有巢穴,才具有迁移、分化、增殖,并最终封闭修复创面的能力。故表皮干细胞离巢是启动包括烧伤在内的创面自行愈合的关键步骤。我们前期实验发现,烧伤后创面即有大量内源性NO产生,刚开始主要产自角朊细胞,随后主要由活化巨噬细胞产生。与其它类型创面相似,烧伤创面局部的NO很快于伤后第三天达到高峰,并几乎存在于创面愈合的全过程。研究发现,NO不光可促进烧伤创面上皮化、肉芽组织形成等,还能明显促进糖尿病创面的愈合,但NO在烧伤后表皮干细胞离巢、迁移等生物学行为变化中的作用并未见文献报道。烧伤后早期即有NO的大量产生,其产生时间上与烧伤后表皮离巢迁移相重叠,NO又能促进烧伤创面的愈合,而表皮干细胞是启动创面愈合的关键步骤之一,故有理由推测,NO很可能在表皮干细胞离巢过程中起着重要作用。为了验证这一假说及其具体作用机制,我们选取HaCat细胞作为模型,硝普钠(SNP)作为NO供体,从RhoGTP酶、细胞骨架、整合素等方面探讨了NO对细胞迁移影响的机制。研究内容和方法:1、以细胞密度为10~5个/ml接种1ml细胞至12孔板,细胞达到85%左右的融合度时进行划痕操作,换液后加入含有终浓度分别为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L硝普钠及10μmol/L丝裂霉素的培养基培养细胞,并在划痕后6、12、24、48小时观察拍照,测量划痕宽度,计算细胞迁移率,筛选出SNP最佳作用浓度及作用时间。实验数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,两两比较用T检验,组间比较采用单因素方差分析。以P值<0.05为差异显著,P值<0.01为差异非常显著,P值>0.05为无统计学意义上的差异。后续实验中数据的统计方法与此相同。2、通过划痕实验测得10μmol/LSNP溶液为最佳浓度,培养最佳时间为24小时。据此,以细胞密度为10~5个/ml接种1ml至六孔板,加入含有终浓度为10μmol/LSNP溶液的无钙1640培养基培养细胞24小时后,超声裂解细胞,离心,取上清液,用Elisa试剂盒检测NO对细胞内cGMP浓度的影响。3、在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以细胞密度10~5个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。4、接种细胞至六孔板,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA、总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。5、接种细胞至六孔板,细胞贴壁后加入含10μmol/LSNP的无钙1640培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1等RhoGTP酶在mRNA水平及在蛋白水平的改变。6、增强或阻断cGMP作用后HaCat细胞功能改变通过以上实验,统计出浓度为10μmol/L的SNP对HaCat细胞的迁移能力增加最显著。在此浓度的基础上,进行划痕实验,观察各种cGMP干扰因子对NO作用的影响。根据加入的cGMP干扰因子不同,将实验分为四个组,分别为cGMP促进剂组、cGMP拮抗剂组、并设立阳性对照组及空白对照组,空白对照组不加入SNP及干扰因子,剩下的三组均加入10μmol/LSNP溶液,在此基础上,cGMP促进剂组加入50μmol/L 8Br-cAMP,cGMP拮抗剂组加入8CPT_cAMP,阳性对照组加入与上述两组等体积的PBS。1)迁移实验:实验分为四个组,接种细胞至12孔板,在细胞完全贴壁后进行划痕操作,在划痕后加入上述四种干扰因子,及阳性对照组、阴性对照组,24小时后测定迁移距离,计算迁移率,并将结果进行统计,具体操作同上。2)在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以浓度10~5个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。3)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。4)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种cGMP干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1在mRNA水平及在蛋白水平的改变。7、增强或阻断蛋白激酶G作用后HaCat细胞功能改变。根据加入的蛋白激酶G干扰因子不同,将实验分为四个组,分别为:蛋白激酶G激动剂组、蛋白激酶G抑制剂组,并设立阳性对照组及空白对照组,空白对照组不加入SNP及干扰因子,剩下的三组均加入10μmol/LSNP溶液,在此基础上,蛋白激酶G激动剂组加入8Br_cGMP;蛋白激酶G抑制剂组加入8CPT_cGMP,阳性对照组加入与上述两组等体积的PBS。1)迁移实验:实验分为四个组,接种细胞至12孔板,在细胞完全贴壁后进行划痕操作,在划痕后加入上述四种干扰因子,及阳性对照组,阴性对照组,24小时后测定迁移距离,计算迁移率,并将结果进行统计,具体操作同上。2)在六孔板预先放置消毒过的盖玻片,以浓度10~5个/ml接种6孔板,每孔接种1ml,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架,DAPI染细胞核,激光共聚焦观察细胞骨架的改变。并设空白对照组,每组3复孔。3)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测β1-整合素在mRNA水平及蛋白水平的改变。4)接种细胞至六孔板,在细胞完全贴壁后加入含上述各种蛋白激酶G干扰因子的培养基,培养细胞24小时后,提取细胞总RNA,总蛋白,检测cdc42,RhoA,Rac1在mRNA水平及在蛋白水平的改变。研究结果1、实验发现,SNP处理细胞6小时、12小时、24小时、48小时后,在0---10μmol/L的浓度范围内,随着SNP的浓度升高,细胞迁移率逐渐增加;含10μmol/LSNP的培养基培养细胞24小时后,迁移率由空白组的64.1%提高至71.2%;而超过此浓度之后,细胞迁移率下降,表明10μmol/L的SNP是促进细胞迁移的最佳浓度。2、应用Elisa检测试剂盒,检测发现,在加入含10μmol/LSNP的培养基培养细胞24小时后,细胞内的cGMP浓度与对照组相比上升11.5%(P值<0.05),表明NO能够促进GTP水解生成cGMP。3、激光共聚焦显微镜显示,阴性对照组纤毛稀少,胞内应力性纤维束纤细,而SNP处理组纤毛明显增多,胞内应力性纤维束增粗,并向细胞边缘聚集。4、应用western blot及PCR检测发现,NO能够明显降低β1整合素在mRNA水平及蛋白水平的表达,与对照组相比,β1整合素的mRNA表达下降了22.9%;蛋白表达下降了31.3%。5、应用western blot及PCR检测发现,NO能够增加cdc42,Rac1,RhoA在mRNA水平及蛋白水平表达,与对照组相比,mRNA表达分别增加了28.2%、26.5%、27.4%;蛋白水平表达增加了30.1%、23.5%、18.4%。6、增强或阻断cGMP作用后HaCat细胞出现下列改变:1)在加入cGMP拮抗剂后,能够抑制NO对细胞迁移的促进作用,迁移率较阳性对照组下降了11.9%;但cGMP促进剂组与阳性对照组比较,并不能增强NO对细胞迁移的促进作用。2)激光共聚焦观察到,在加cGMP拮抗剂后,与阳性对照组比较,微丝、微管、纤毛数量减少,应力性纤维束变细。表明cGMP拮抗剂,抑制了一氧化氮对HaCat细胞骨架的影响;在加入cGMP促进剂,HaCat细胞的微丝,微管等结构与阳性对照组相比,没有发生结构的改变,纤毛数量也没有增加。3)PCR结果显示,在加入cGMP促进剂后,HaCat细胞cdc42,Rac1,RhoA在mRNA水平较阳性对照组没有增加;在加cGMP拮抗剂后,与阳性对照组比较,cdc42、Rac1、RhoA分别下降了25.0%、17.2%、19.8%;表明抑制了NO对HaCat细胞RhoGTPase在mRNA水平的表达。而β1整合素在加入四种干扰因子后较阳性对照组均没有具有统计学意义的增加或者减低。4)WB结果显示,在加入cGMP促进剂后,HaCat细胞cdc42,Rac1,RhoA在蛋白水平较阳性对照组没有增加;在加cGMP拮抗剂后,与阳性对照组比较,cdc42、Rac1、RhoA分别下降了17.8%、19.4%、21.1%;而β1整合素在加入四种干扰因子后较阳性对照组均没有具有统计学意义的增加或者减低。7、增强或阻断蛋白激酶G作用后HaCat细胞出现下列改变:1)在加入蛋白激酶G抑制剂后,能够抑制NO对细胞迁移的促进作用,迁移率较阳性对照组下降了10.2%;但蛋白激酶G激动剂组与阳性对照组比较,并不能增强NO对细胞迁移的促进作用。2)激光共聚焦观察到,在加蛋白激酶G抑制剂后,较阳性对照组比较,微丝,微管,纤毛数量减少,应力性纤维束变细。表明蛋白激酶G抑制剂,抑制了一氧化氮对HaCat细胞骨架的影响;在加入蛋白激酶G激动剂,HaCat细胞的微丝,微管等结构与阳性对照组相比,没有发生结构的改变,纤毛数量也没有增加。3)PCR结果显示,在加入蛋白激酶G激动剂后,HaCat细胞cdc42,Rac1,RhoA在mRNA水平较阳性对照组没有增加;在加蛋白激酶G抑制剂后,与阳性对照组比较,cdc42、Rac1、RhoA分别下降了28.8%、20%、17.8%;表明抑制了NO对HaCat细胞cdc42,Rac1,RhoA在mRNA水平的表达。而β1整合素在加入四种干扰因子后较阳性对照组均没有具有统计学意义的增加或者减低。4)WB结果显示,在加入蛋白激酶G激动剂后,HaCat细胞cdc42,Rac1,RhoA在蛋白水平较阳性对照组没有增加;在加蛋白激酶G抑制剂后,与阳性对照组比较,cdc42、Rac1、RhoA分别下降了14.7%、17.4%、20.0%;而β1整合素在加入两种干扰因子后较阳性对照组均没有具有统计学意义的增加或者减低。结论适宜浓度的外源性NO可促进培养人表皮角质成型细胞的迁移,提示其可能在皮肤创面修复起着重要作用。其作用机制可能为NO促进GTP水解生成cGMP增强,随着cGMP的增高,一方面,β1整合素表达下降,另一方面,Rho GTP酶的表达增强,引起微丝、微管向细胞边缘聚集,纤维束增粗等结构的改变,从而引起细胞的迁移能力增强。