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研究背景内皮功能障碍是多种代谢性疾病的一种特性,是早期血管功能障碍的一个关键事件。氧化应激是引起内皮功能障碍的重要机制之一。维生素E是细胞抗氧化防御系统中主要的脂溶性成分。许多临床研究以α-生育酚的形式补充维生素E,作为一种改善内皮功能和降低心血管疾病风险的方法,但是效果并不明确。近年来一些临床和动物实验表明,γ-生育酚可能是维生素E实际上的保护性亚型,通过不同机制起到心血管保护作用。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）是血管一氧化氮（nitric oxide,NO）的主要来源,也是一个具有抗炎作用的细胞保护分子。在糖尿病和与胰岛素抵抗相关的心血管疾病如高血压和动脉粥样硬化中都存在NO的生物利用度减少的现象。因此,改善内皮细胞NO生物利用度将对缓解/治疗内皮功能障碍相关心血管疾病有重要意义。γ-生育酚可以上调e NOS并促进NO形成,可能在防治血管内皮功能障碍中发挥重要作用。虽然亲脂性的γ-生育酚有直接的抗氧化和抗炎作用,但它很容易在肝脏以细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）依赖的方式代谢成其生理水基代谢物γ-2-（2’-羧乙基）羟基苯并二氢吡喃（γ-Carboxyethyl-6-hydroxychromans,γ-CEHC）。虽然以往的研究支持γ-生育酚自身在啮齿动物和人类的有利影响,但对其生理代谢产物γ-CEHC的作用尚并不清楚。有限的证据表明,γ-CEHC可以抑制内皮细胞在炎症刺激时的炎性反应,然而,γ-CEHC是否可以在糖尿病和/或代谢综合征等高血糖条件下改善内皮细胞的e NOS信号尚不清楚。实验目的1.明确γ-生育酚是否通过激活e NOS/NO信号通路和降低炎症反应,改善高血糖引起的内皮功能障碍。2.阐明γ-生育酚保护血管功能的具体机制,尤其是其代谢产物γ-CEHC在其中的作用。实验方法1.实验分组:（1）正常对照组（CON）,8周龄正常野生型C57Bl/6小鼠,给予标准饲料（Research Diets Inc.,New Brunswick,NJ）喂养,含10%脂肪,70%碳水化合物和20%蛋白（k Cal）;（2）db/db小鼠组（db/db）,db/db小鼠给予标准饲料喂养;（3）db/db小鼠+γ-生育酚组（db/db+γ-T）,db/db小鼠给予标准饲料,并按照γ-生育酚500 mg/kg体重的比例给予。经过1周适应环境后,所有小鼠都按照上述条件喂养8周。8周后检测各组小鼠的代谢指标和心血管表型。2.离体观察外周血管收缩舒张功能:制备股动脉环（内径约150μm）检测血管反应性。给予氯化钾（KCl）诱导血管最大张力（Lmax）,用苯肾上腺素（PE,1μM）使血管环预收缩65%的Lmax张力,分别给予乙酰胆碱（ACh,10-8-10-6 mol/L）、硝普钠（SNP,10-9-10-4 mol/L）检测内皮依赖性和非内皮依赖性血管舒张的剂量反应曲线。分别给予PE（10-9-10-4 mol/L）、KCl（20-100 m M）检测受体依赖性和非受体依赖性血管收缩的剂量反应曲线。给予NOS抑制剂（L-NAME）,检测各组小鼠血管的收缩反应。3.培养牛主动脉血管内皮细胞（Bovine aortic endothelial cells,BAECs）:在培养基中添加35 m M葡萄糖孵育48 h制造高糖模型,同时给予生理浓度的γ-生育酚（1.2μM）,处理结束前10 min给予100 n M胰岛素,处理结束后收集细胞分别用免疫印迹方法、q-RT PCR方法和ELISA方法探讨γ-生育酚的保护作用及机制。4.人主动脉血管内皮细胞（Human aortic endothelial cells,HAECs）细胞培养:使用生理浓度的γ-CEHC（3μM）对HAECs预处理24 h,再在培养基中添加20 m M葡萄糖制造高糖模型孵育48 h,处理结束前10 min给予100 n M胰岛素,处理结束后收集细胞分别用免疫印迹方法、q-RT PCR方法和ELISA方法观察γ-CEHC的保护作用及机制。5.采用免疫印迹方法检测e NOS,p-e NOSSer1177,Akt,p-AktSer473,ERK,p-ERKThr2023/Tyr204),AMPK,p-AMPKThr172,GSK3β,p-GSK3βSer9,ACC,p-ACCSer79,硝基酪氨酸和e NOS dimers/monomers的蛋白表达水平。6.采用q-RT PCR方法检测细胞粘附因子（intercellular adhesion molecular-1,ICAM）,血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）,E-Selectin,单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）和白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）的基因表达水平。7.采用ELISA方法检测细胞内NO和ROS的水平。实验结果1.与对照组相比,db/db组小鼠的体重、肝脏和脂肪的重量显著增加（p<0.05）,给予γ-生育酚的db/db小鼠体重下降但是肝脏和脂肪的重量不变;与对照组相比,db/db组小鼠的禁食后血糖、HDL和甘油三酯显著增高（p<0.05）,给予γ-生育酚对这些指标无影响;在各组实验小鼠中,心脏重量和总胆固醇量无显著变化。2.与对照组相比,db/db组小鼠内皮依赖性舒张功能显著降低（p<0.05）,给予γ-生育酚后得到恢复。各组小鼠之间血管的非内皮依赖性舒张、受体介导的收缩和非受体介导的收缩无显著差异。与对照组相比,db/db组小鼠通过L-NAME诱发的血管收缩显著降低（p<0.05）,给予γ-生育酚后得到恢复。股动脉起始宽度,结束宽度,长度,最大静息张力,内皮依赖性舒张百分比,非内皮依赖性舒张百分比和给予NOS抑制剂后的舒张百分比,各组之间无显著差异。3.与对照组相比,db/db组小鼠血管e NOSSer1177的磷酸化水平显著降低（p<0.05）,给予γ-生育酚后得到恢复。与对照组相比,db/db组小鼠血管AktThr308的磷酸化水平,AMPKThr172的磷酸化水平和ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化水平,各组之间无显著差异。4.与对照组相比,高糖组胰岛素刺激引起的e NOSSer1177的磷酸化水平和NO水平都显著降低（p<0.05）,给予γ-生育酚预处理后得到恢复。在不同的处理组之间,基础的e NOSSer1177的磷酸化水平和NO水平无显著差异。5.与对照组相比,高糖孵育48 h后,BAECs中总ROS-RNS水平显著增加（p<0.05）;给予γ-生育酚处理能降低高糖引起的ROS-RNS水平,使总ROS-RNS水平恢复至对照组水平。与对照组相比,高糖能显著增加炎症因子和粘附因子的表达（p<0.05）;但是,给予γ-生育酚处理能显著降低高糖引起的炎症因子增高。6.与对照组相比,高糖组胰岛素刺激引起的eNOS的磷酸化水平,Akt的磷酸化水平和NO水平都显著降低（p<0.05）;给予γ-CEHC预处理后得到恢复。在不同的处理组之间,基础e NOSSer1177的磷酸化水平和NO水平无显著差异。AMPKThr172的磷酸化水平,ERK1/2Thr202/Tyr204的磷酸化水平,GSK3βSer9的磷酸化水平和ACCSer79的磷酸化水平各组之间无显著差异。7.与对照组相比,高糖孵育48 h后,HAECs中总ROS-RNS水平和硝基酪氨酸蛋白表达显著升高（p<0.05）;给予γ-CEHC预处理能阻止高糖引起的ROS-RNS水平增加,使总ROS-RNS水平与对照组类似。与对照组相比,高糖孵育48 h后,HAECs中e NOS解偶联显著增加（p<0.05）;给予γ-CEHC预处理能防止高糖引起的e NOS解偶联,使e NOS保留一个正常的二聚体与单体的比例。8.与对照组相比,高糖能显著增加炎症因子和粘附因子（ICAM,VCAM-1,E-Selectin,MCP-1和IL-8）的基因表达（p<0.05）。给予γ-CEHC预处理能显著降低高糖引起的ICAM,VCAM-1,E-Selectin,MCP-1和IL-8基因表达增高（p<0.05）。结论1.γ-生育酚可以改善高血糖所致的血管功能障碍;2.γ-生育酚通过降低氧化应激和炎症反应,提高NO的生物利用度改善内皮功能,该保护作用部分是由其代谢产物γ-CEHC介导的。