软骨藻酸(Domoic acid,DOM)是一种海洋生物毒素,具有强烈的神经毒性,是呈晶体状并可溶于水的酸性氨基酸,其分子式为C15H21NO6,分子量为311.33,分子中含有三个羧基。它可对海洋野生动物和人类健康产生影响,如在啮齿类动物模型中DOM产前暴露会影响发育。DOM是由拟菱形藻(Pseudo-nitzschia)属藻类所产生,是一种红藻氨酸的类似物,可导致失忆性贝类中毒,与临时性或永久性的记忆丧失、神经坏死、癫痫发作等相关,高剂量摄入可致死。在全世界各海域,DOM由拟菱形藻产生并积聚在贝类、沙丁油鱼和凤尾鱼等体内。因此DOM的高特异性、高灵敏度的检测显得至关重要。DOM是一种典型的半抗原,无法直接在动物体内诱导产生免疫应答,需要与载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联形成完全抗原。DOM-BSA和DOM-OVA通过活泼酯法进行偶联,并以DOM-BSA作为完全抗原,与弗氏完全佐剂混合乳化进行首次免疫BALB/c小鼠,随后的免疫以弗氏不完全佐剂进行。五次免疫后,通过iELISA测定血清效价。结果表明1号小鼠具有最高效价1:256,000。因此,选取1号小鼠用于细胞融合。在无菌环境下无痛处死小鼠,分离脾脏,将脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0(融合前培养SP2/0至对数生长三天,37℃、5%CO2和95%湿度)进行融合。以RPMI-1640(10%FBS)培养杂交瘤细胞7至10天,在倒置显微镜下观察,并通过iELISA筛选阳性杂交瘤克隆以分泌所需抗体。经过筛选得到一株阳性克隆,命名为1C3。杂交瘤细胞是两个不同的细胞的融合子,即BALB/c小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,分别有39至40个、62至68个染色体[1]。因此,杂交瘤的染色体总数必须等于或高于融合亲本。1C3克隆的染色体数为102±4,进一步证实该杂交瘤细胞由两亲本融合形成。培养上清液无法产生较高浓度的单克隆抗体。因此,将处于指数生长的杂交瘤细胞注射至已用降植烷致敏的BALB/c小鼠以制备抗DOM腹水抗体。单克隆抗体用硫酸铵(NH4)2SO4沉淀法纯化,以BCA法测得浓度为1.63毫克/毫升。对单克隆抗体进一步表征以作免疫分析应用,结果表明,该单抗属于IgG3亚型,并有较高滴度。以不同的DOM-OVA包被浓度(0.25,0.5,1 and 2μg/mL)及梯度稀释的单克隆抗体(1 μg/mL)进行ELSIA测得该抗体的亲和力数为2.5 x 108 L/mol。以ic-ELISA建立了免疫分析法的标准曲线,结果表明LOD为0.006 ng/mL。之后,以当地海产品市场获得实际样品进行DOM浓度的测定,结果表明所测试样品未检测到毒素的污染。