论文部分内容阅读
目的:利用2型登革病毒(Dengue Virus 2 Type,DENV-2)感染的人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)与免疫细胞相互作用,并受S1P1受体特异性激动剂(CYM-5442)干预后,对细胞因子产生的影响。2、利用CYM-5442处理DENV-2感染的Balb/c小鼠,分析不同器官免疫细胞的分布特点,血清细胞因子的动态变化,探讨其可能发生的免疫机制。方法:1.登革Ⅱ型病毒(DENV-2)感染HUVECs后,观察HUVECs的超微结构;2.密度梯度离心PBMC,采用磁珠分选Treg、单核细胞,利用巨噬细胞集落刺激因子将单核细胞诱导分化为巨噬细胞。3.采用Transwell法,HUVEC分别与Treg、单核细胞、巨噬细胞共培养,并设S1P1受体特异性激动剂干预组,检测各组HUVECs分泌炎性细胞因子的水平,检测各组Treg分泌抑炎性细胞因子的水平。4.皮下多点注射Balb/c小鼠,建立DENV感染模型,72h收集外周血,分离血清,接种C6/36细胞,观察细胞病变;qPCR检测DENV-2NS1基因部分序列。5.流式细胞术检测各组小鼠外周血、肝脏免疫细胞的类型和比例;双抗体夹心ELISA法检测血清炎性细胞因子的动态变化;HE染色检测各组小鼠肝、脾、肾和脑组织的病理变化,全自动生化仪检测各组小鼠肝、肾功能。结果:1.流式细胞仪检测膜表面分子CD31表达率为98.96%,免疫组化方法检测HUVEC的Ⅷ因子相关抗原,细胞浆内为棕黄色,符合HUVECs的特征。2.磁珠分选CD4+CD25+CD127+Treg 细胞,经流式细胞仪测定 Treg 表面 CD4+CD25+CD127+的表达(84.2%);磁珠分选CD14+CD16-单核细胞,经流式细胞仪测定单核细胞表面CD14+CD16-的表达(94.8%);经巨噬细胞集落刺激因子诱导培养单核细胞5天后检测巨噬细胞表面CD14+CD1 1b+的表达(96.8%),均达到后续实验要求。3.HUVECs被DENV-2感染后,分别与Treg、单核细胞、巨噬细胞共培养、S1P1受体特异性激动剂干预组以及对照共6个实验组,发现感染组较未感染对照组培养HUVEC表达的IL-8呈先升高后降低趋势,4h(10.62±1.97),8h(22.28±3.85),12h(19.37±3.24),24h(26.80±5.81),36h(15.12±2.37),48h(10.71±1.80),72h(8.81 ±1.50),24h 达到峰值,P<0.001;加入 S1P1 受体特异性激动剂组与Treg、单核细胞、巨噬细胞共培养处理组比较,HUVEC表达的IL-8的表达则显著下调,有统计学差异(P<0.05)。感染组较未感染对照组比较,IL-6 相对表达具有显著差异(P<0.001),4h(16.55±2.68),8h(20.55±4.01),12h(31.37±4.18),24h(41.83±5.24),36h(28.83±4.25,),48h(20.36±3.85),72h(13.52±1.97),呈先升高后降低趋势;HUVEC表达的IL-6在S1P1受体特异性激动剂组较与Treg、单核细胞、巨噬细胞共培养处理组比较显著下调(P<0.05);S1P1受体特异性激动剂共培养组较Treg、单核细胞、巨噬细胞共培养处理组HUVEC表达的TNF-a、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的水平显著下调(P<0.05)。HUVEC与Treg细胞共培养组Treg细胞所产生的IL-10、TGF-β均显著升高。4.动物实验结果证实,DENV-2皮下多点注射Balb/c小鼠72h后收集外周血,分离病毒,qRT-PCR检测病毒核酸NSI部分序列,琼脂糖凝胶电泳产物长度约400bp,与理论值相符。同时取各组小鼠血清接种C6/36细胞,第5天见细胞出现典型空泡、拉丝等改变,确定病毒感染模型建立成功。DENV-2感染小鼠受S1P1受体特异性激动剂CYM-5442作用,干预组较DENV感染组血清中各时间点IL-8、IL-6、TNF-a、MCP-1、VCAM-1、CCL-2炎症细胞因子表达明显下降(P<0.05)。外周血及肝脏单核细胞/巨噬细胞、NK细胞比例在感染组较对照组显著升高(P<0.001),注射CYM-5442干预组较感染组明显下降(P<0.05)。而Treg细胞在外周血中的比例四组均无统计学差异(P>0.05)。通过对感染小鼠不同器官HE染色,感染组病理损害最重,CYM-5442干预后能减轻病理损害;肾脏和脑组织均无明显病理变化。同时感染组小鼠肝功能ALT(62.31±10.95u/l),AST(52.33±11.58u/l),LDH(398.17±38.24 u/l)TBIL(28.58±8.25 umol/1)较其他组出现显著异常(P<0.05),而肾功能四组均正常。结论:HUVECs被DENV2感染后与不同免疫细胞共培养,受CYM-5442作用,炎性细胞因子的产生有显著变化。被DENV-2感染的HUVECs能促使Treg细胞对抑炎性细胞因子的分泌上调。证明HUVEC可能通过产生细胞因子对不同免疫细胞发挥免疫调节作用。建立了被DENV-2感染的Balb/c小鼠动物模型,S1P1受体特异性激动剂CYM-5442的干预显著下调各种炎性细胞因子的表达,可保护靶器官的损伤。受DENV感染后,血管内皮细胞与免疫细胞之间可发挥相互的免疫调节作用;S1P1受体特异性激动剂对DENV感染造成的组织损伤具有一定的保护作用。