论文部分内容阅读
目的:Hippo-YAP通路是调节细胞增殖,细胞间接触抑制以及组织器官大小的关键通路之一,在肿瘤的发生发展过程中发挥着至关重要的作用。该通路中共转录因子YAP1由于缺少DNA结合结构域,可通过结合转录因子TEAD4从而靶定并调控下游基因的转录,从而实现对细胞增值和组织器官发育的调控作用。YAP1作为Hippo-YAP通路中的核心因子,是已经有很多报道的原癌基因,也是目前临床诊断和治疗癌症的重要靶点,对其细胞生物功能进行分子机制层面的深入探讨,发现新的具有拮抗作用的信号通路具有重要意义。在现有的模型中,Hippo通路主要是通过蛋白磷酸化和泛素化降解机制来调控的。除此之外,在RNA调控水平上,一些Hippo通路的重要组成成分受到了选择性剪接的调控。RNA选择性剪接是决定蛋白多样性的重要原因。选择性剪接的发生依赖基因顺式作用元件及其招募的反式作用因子,其中剪接因子的细胞特异性和组织特异性表达,细胞核内外定位,及其活性影响着剪接事件的最终结果。选择性剪接异常会导致蛋白功能异常,与众多疾病的发生发展密切相关。越来越多的证据表明RNA的异常剪接可以影响肿瘤的重要表型特征,但剪接异常的生物学影响特别是在肿瘤中的生物学影响仍然少有报道。在本实验室前期研究中发现,剪接因子RBM4在肿瘤中的异常表达可以促使TEAD4产生一种短的剪接本,命名为TEAD4-S。TEAD4-S和经典剪接本TEAD4-FL的蛋白结构域的不同,很可能影响到YAP1的促癌功能。本文的研究旨在从RNA剪接调控的层面阐明TEAD4异常剪接在肿瘤中的功能及其调控Hippo-YAP通路的具体机制。方法:1.通过PCR和Western blot的实验方法检测TEAD4-S在H157细胞和不同组织器官中的表达情况。2.通过免疫荧光实验技术观察TEAD4-S的细胞定位。3.构建四环素诱导稳定表达RBM4的HEK293T细胞系,在四环素的诱导下通过PCR和Western blot的方法检测RBM4对TEDA4剪接的影响。以及在不同的过表达RBM4的肿瘤细胞系中检测其对TEAD4剪接的影响。4.通过构建剪接报告基因、引入突变、RIP等实验方法阐述RBM4影响TEAD4剪接的具体靶定位点。5.用免疫共沉淀实验证明TEAD4-S是否与YAP存在相互作用。6.通过染色质免疫共沉淀实验验证TEAD4-S是否仍然具有靶向DNA的功能。7.通过瞬时转染,免疫共沉淀实验验证TEAD4-S是否影响了TEAD4-FL与YAP的结合能力。8.使用荧光素酶报告系统等方法验证TEAD4-S对YAP共转录活性的影响。9.通过软琼脂、平板克隆、Western blot实验评估TEAD4-S对H157,A549细胞系增殖和EMT的影响。10.建立动物模型,验证TEAD4-S在体内环境下对肿瘤发生发展的影响。结果:1.TEAD4-S在H157细胞和不同组织器官中均有表达。2.TEAD4-S在核质中均匀表达,TEAD4-FL则主要定位在细胞核中。3.RBM4的表达调控了TEAD4-S的产生。4.RBM4是通过CGGCCGG基序来实现对TEAD4剪接调控的。5.TEAD4-S C端依然具有和YAP结合的功能。6.TEAD4-S N端失去了靶向靶基因的功能。7.TEAD4-S的存在破坏了TEAD4-FL和YAP的相互作用。8.TEAD4-S可以通过拮抗TEAD4-FL来影响YAP的活性。9.TEAD4-S的过表达能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。10.在小鼠移植瘤模型中,TEAD4-S的表达可以抑制肿瘤的增长。TEAD4-S在人的肿瘤中是低表达的,并且TEAD4-S表达量高的肿瘤病人有更长的总体生存期。结论:抑癌剪接因子RBM4的高表达可以上调TEAD4-S,TEAD4-S失去了DNA靶向功能但依然可以结合YAP,进而通过拮抗TEAD4-FL抑制了YAP的活性,从而抑制了肿瘤的生长。据目前我们了解所知,这是首次报道Hippo-YAP通路可以受到RNA剪接的调控。该研究模型为我们提供了一种全新的肿瘤研究思路和策略。