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黑色素是由黑色素细胞合成,毛发中沉着的黑色素决定着皮毛的种类。小眼畸形转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor,MITF)调控很多的色素生成相关的酶,是至关重要的转录因子。酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR),酪氨酸激酶相关蛋白1(Tyrosinase related protein 1,TYRP1)和酪氨酸激酶相关蛋白 2(Tyrosinase related protein 2,TYRP2)是MITF重要的下游基因,也是调控色素合成的关键酶。因此,许多不同的外界信号通过调控MITF及其下游基因的表达来影响黑色素的生成。MicroRN A(miRN A)是高度保守的非编码RNA,在动物中miRNA通过与靶基因的结合抑制靶基因的转录后调控。本研究通过TargetScan预测软件,发现miR-101-3ip和miR-144-3p在Mitf的3’UTR上有相同的结合位点。通过实时荧光定量,western blotting和免疫组织化学确定miR-101-3p和miR-144-3p对黑色细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的调控,并进一步探索作用于靶基因同一位点的miR-101-3p和miR-144-3p调控机制。1.经DNAMAN软件分析,发现人、小鼠、牛、鸡等物种的miR-101-3p和miR-144-3p的同源性极高,为100%。人、小鼠、牛、骆驼等物种的Mitf3’UTR的同源性极高,同源性系数均为80%以上。通过TargetScan预测显示miR-101-3p和miR-144-3p与Mitf的3UTR都有靶向作用且结合位点相同,且miR-144-3p的碱基互补率大于miR-1 01-3p的碱基互补率。2.运用PCR 检测 miR-101-3p、miR-1 44-3p 及 Mitf、Tyr、Tyrp1、Tyrp2 在羊驼黑色素细胞内的内源、性表达,结果显示miR-101-3p、miR-144-3p及Mitf、Tyr、Tyrp1、Tyrp2在羊驼黑色素细胞内均表达。3.通过在黑色素细胞内转染miRNA mimic(miRNA成熟体)过表达miRNA和miRNA inhibitor(miRNA抑制剂)抑制miRNA的表达。黑色素含量测定的结果显示,分别转染miR-101-3p mimics和miR-144-3p mimics后,黑色素细胞合成的黑色素细胞较正常组都减少(P<0.001)且转染miR-144-3p mimics黑色素细胞合成的黑色素少于转染miR-101-3p mimics 黑色素细胞合成的黑色素(P<0.05)。miR-101-3p mimics 和miR-144-3p mimics(1:1)转染组黑色素的生成量高于转染miR-144-3p mimics的黑色素细胞(P<0.05),低于转染miR-101-3p mimics 的黑色素细胞(P<0.05)。转染miR-101-3p inhibitors和miR-144-3p inhibitors后,黑色素的合成较正常组都增加(P<0.01)且转染miR-144-3p mimics黑色素细胞合成的黑色素高于转染miR-101-3p mimics黑色素细胞合成的黑色素(P<0.05)。miR-101-3p inhibitors 和 inhibitors 等比例共转染组黑色素的生成量高于转染miR-144-3p inhibitors的黑色素细胞(P<0.05),低于转染miR-101-3p inhobitors的黑色素细胞(P<0.01)。4.通过实时qRT-PCR、western blotting和免疫组织化学的方法检测转染后的黑色素细胞miR-101-3p、miR-144-3p、MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的基因和蛋白的表达。结果显示,miR-101-3p和miR-144-3p过表达后,Mitf mRNA的表达量并没有发生显著的变化,Tyr、Tyrp1和Tyrp2 mRNA 显著减少(P<0.001),且miR-101-3p mimics 和miR-144-3pmimics等比例共转染组Tyr、Tyrp1和Tyrp2 mRNA的表达量高于miR-144-3p mimics 转染组(P<0.05),低于miR-101-3p mimics 转染组(P<0.05)。Western blotting 和免疫组织化学结果显示MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白表达显著降低(P<0.001),且miR-101-3p mimics和miR-144-3p mimics等比例共转染组MITF和TYR蛋白的表达量高于miR-144-3p mimics 转染组(P<0.05),低于 miR-101-3p mimics 转染组(P<0.05)。转染miRNA inhibitors 后,miR-101-3p inhibitors 和 inhibitors 等比例共转染组MITF、TYR、TYRP1 和 TYRP2 蛋白的表达量高于miR-144-3p inhibitors 转染组(P<0.01),低于 miR-1 01-3p inhibitors 转染组(PP<0.01)。综上所述:通过采用过表达miR-101-3p,过表达miR-144-3p和等比例过表达miR-101-3p和miR-144-3p的方式,在细胞水平上研究了 miR-101-3p和miR-144-3p对羊驼黑色素细胞色素形成的调控作用,揭示了miR-101-3p和miR-1 44-3p可以通过调节MITF的表达间接调控酪氨酸酶家族基因的表达进而影响黑色素的合成。同时,还揭示了在同一基因具有相同结合位点的miRNAs是独立发挥作用的,彼此不存在竞争或者协同的关系。此研究结果不仅丰富了黑色素形成机制的理论知识。同时还首次揭示了在同一基因具有相同结合位点的miRNAs之间的作用机制。为miRNAs遗传修饰的基因工程提供重要的基因资源和实验依据。