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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球发病率最高的恶性肿瘤之一,五年存活率仅为7%,高居癌症致死原因的第三位。美国癌症协会(ACS)最新发布的2016年度“生死”大数据报告指出,肝癌、胰腺癌、子宫体癌等的死亡率正逐步上升。我国是世界上肝癌发病率较高的国家,全球每年有超过50万人罹患肝癌,而其中一半以上在中国(1)。目前,导致肝癌的主要原因是慢性乙肝感染(2),同时诸如丙型肝炎感染、食用含黄曲霉素食物、吸烟、酗酒等等也是重要原因(3,4),而近几年来糖尿病、肥胖等疾病发病率不断增高,这些也是导致肝癌的高危因素,因此,在今后相当长的一段时间内,肝癌在中国的发病现状很不乐观。 肝癌的早期筛查所使用的临床诊断标志物是甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP),但这并不是最理想的分子标志物,并且由于中早期的肝癌并无明显的临床表现,因此仍然会造成至少1/3的肝癌患者漏诊,同时由于肝癌发展迅速,不易察觉,最终导致这些患者在首诊时便被确诊为晚期,失去了最佳的治疗时机,这些患者的预后相当差。 对肝癌的治疗的传统方法即手术加化疗或者放疗,但是这些方法具有一定的局限性;同时肝癌的生物治疗目前还不成熟,复发率很高,预后较差。因此,要提高肝癌患者的生存率,应加强肝癌分子病理机制的研究,寻找影响癌症发生发展的相关基因,包括癌基因和抑癌基因,探讨肝癌生物治疗的新途径。 影响肿瘤发生发展的基因主要有两类,一类是致癌基因,这是一种参与细胞生长、分裂和分化的正常的原癌基因发生突变后形成的,例如ras家族基因、myc家族基因、sis家族基因等等。另一类是抑癌基因,也称为抗肿瘤基因或者抗癌基因,例如Rb基因、p53基因、BRCA基因等等。与其他恶性肿瘤一样,大量的癌基因和抑癌基因参与肝癌的发生和发展。例如,MAEL基因在肝癌组织中过表达,且与肝癌复发及不良预后呈显著相关,并促进了AKT活性、GSK-3β磷酸化和Snail稳定性,最终又到了上皮间质转化(EMT),并促进了肿瘤的侵袭和转移。癌症相关基因的研究,不仅有助于理解肝癌发生发展的分子生物学机制,也可以为寻找新的早期诊断标志提供理论与技术基础,最后可以为探索利用分子生物学方法研发抗肿瘤药物提供方向。 本研究内容主要分为两部分,第一部分探讨着丝粒蛋白CENP-K基因的表达失调在肝癌发生发展中的作用。前期基因芯片技术发现CENP-K基因在肝癌患者中呈高表达,我们进一步利用RT-PCR,荧光定量PCR以及免疫组化技术证实了CENP-K在肝癌患者组织中的表达情况;构建了CENP-K的真核表达载体,利用细胞增值曲线、平板克隆形成、transwell以及小鼠成瘤实验,分析了过表达或者干扰CENP-K的表达对肝癌细胞生长以及迁移的影响;DNA亚硫酸盐测序技术分析了肝癌组织中CENP-K启动子区域的甲基化水平;最后利用免疫印迹技术检测了CENP-K对相关通路蛋白磷酸化水平的影响。研究结果表明,CENP-K在60%的肝癌病例中表达上调,并且与其启动子区域的DNA低甲基化呈现一定的相关性;CENP-K的过表达能够促进肝癌细胞SMMC7721以及Focus的增殖以及迁移,而在QGY7703以及MHCC-LM3干扰CENP-K的表达,细胞的增殖及迁移能力明显减弱。免疫印迹实验结果显示,CENP-K通过调控AKT/TP53信号通路促进肝癌细胞的增殖。 第二部分研究主要针对抑癌基因ARID1A。我们通过荧光定量PCR技术正是ARID1A基因在肝癌患者中呈低表达,而前期的研究发现ARID1A在肝癌患者中同时还存在高频突变;我们得到了ARID1A的真核表达载体并在此基础上构建了两个ARID1A的功能域缺失突变体;利用细胞增值曲线、以及transwell分析了过表达或者干扰ARID1A的表达对肝癌细胞生长以及迁移的影响;蛋白芯片技术对ARID1A在肝癌细胞中发挥作用的信号通路进行筛选。研究结果表明,ARID1A的过表达能够抑制肝癌细胞SMMC7721以及QGY7703的增殖以及迁移。蛋白芯片结果显示,在过表达ARID1A后的肝癌细胞中,磷酸化水平变化较明显的分子,多集中于AKT信号通路上。 本项研究显示CENP-K以及ARID1A基因都在肝癌发生发展中发挥着重要作用,可作为肝癌诊断以及药物设计的靶点。