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背景:双特异性T细胞激动剂BiTE(bispecific T cell engager)是一种以T细胞作为效应细胞的双特异性抗体,可以同时和T细胞及靶细胞结合,并激活细胞毒性T细胞杀伤靶细胞,是一种极具发展潜力的新型抗体。BiTE具有较好的特异性和亲和力,在肿瘤靶向治疗领域具有广泛的应用前景。但是BiTE也存在着一些不足,比如单链抗体scFv稳定性不佳、表达产量低和易聚合等缺点。因此选择结合能力更强的抗体,更特异性的靶标,制备功能效应更为强大的BiTE是当前急需解决的问题。目的:运用基因工程技术,构建基于纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE,并对其进行生物学功能鉴定,探讨其能否诱导T细胞靶向肿瘤细胞,发挥抗肿瘤效应,为BiTE的肿瘤细胞免疫靶向治疗提供一种新的策略。方法:为了构建基于纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE,我们将抗人FAP的纳米抗体序列与抗人CD3纳米抗体序列通过灵活的柔性Linker连接,获得CD3-FAP/nanoBiTE的目的基因,连接表达质粒载体后,转化入大肠杆菌中优化表达,并通过蛋白质免疫印迹实验进行验证。通过流式细胞术验证其特异性结合靶细胞的能力。通过流式细胞术检测经CD3-FAP/nanoBiTE修饰后T细胞表面活化分子CD25和CD69的表达水平。流式细胞术检测经CD3-FAP/nanoBiTE修饰后T细胞的增殖能力。用ELISA方法检测CD3-FAP/nanoBiTE修饰的T细胞释放细胞因子IL-2、TNF、IFN-γ的水平。流式细胞术检测T细胞经CD3-FAP/nanoBiTE修饰后对肝癌细胞HepG2-FAP的杀伤作用。在NOD/SCID小鼠体内构建肝癌移植瘤模型,经CD3-FAP/nanoBiTE治疗后,观察荷瘤小鼠的肿瘤体积变化和小鼠生存时间,探究其在体内的抗肿瘤效应。结果:将抗FAP的纳米抗体与抗CD3的纳米抗体基因融合,得到基于纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE基因。CD3-FAP/nanoBiTE在转化菌内表达后经Ni亲和层析柱分离后纯度可达90%以上,检测到CD3-FAP/nanoBiTE蛋白主要以不溶性包涵体的形式表达,在50和100mM咪唑之间的洗脱曲线中观察到清晰的峰。收集的蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果显示在约42KD处出现一条清晰的条带,说明CD3-FAP/nanoBiTE蛋白表达成功。流式细胞术检测结果显示CD3-FAP/nanoBiTE能特异性结合T细胞和表达FAP的靶细胞(HepG2-FAP)。流式细胞术检测结果显示在靶细胞HepG2-FAP存在的情况下,CD3-FAP/nanoBiTE修饰的T细胞表面活化分子CD25和CD69表达水平显著高于对照组。流式细胞术检测结果显示在靶细胞HepG2-FAP存在的情况下,经CD3-FAP/nanoBiTE修饰的的T细胞的增殖指数高于其他对照组。ELISA检测结果显示经CD3-FAP/nanoBiTE修饰的T细胞的细胞因子(IL-2、TNF、IFN-γ)的分泌水平高于其他对照组。经CD3-FAP/nanoBiTE修饰的T细胞能在体外能特异性杀伤HepG2-FAP细胞,并且杀伤效果随着效靶比的增高而增强,而对阴性对照细胞Hep无杀伤作用。体内实验结果表明CD3-FAP/nanoBiTE能在荷瘤小鼠体内有效地抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的存活时间。结论:本研究成功构建了基于纳米抗体的新型双特异性T细胞激动剂CD3-FAP/nanoBiTE,在体内、外实验中显示出良好的靶向抗肿瘤作用,本研究为BiTE为肿瘤细胞免疫靶向治疗提供了一种新的策略。