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果胶是一种存在于高等植物细胞壁中的酸性杂多糖,来源广泛,廉价易得。近年来,越来越多的研究者开始关注果胶的构效关系,并通过化学方法、酶法和物理方法等手段对果胶进行降解以获得具有生物活性的改性果胶。但是,化学方法污染严重,难以控制;物理方法降解效率较低,且多停留在实验阶段;酶法虽具有高效、专一性强等优点,但由于酶的造价昂贵导致生产成本提高。近年来,研究者开始将超声波应用于酶促反应中促进聚合物的降解,该方法具有高效率、高选择性和绿色环保等优点。但是,关于超声波在果胶酶促反应中的应用至今鲜有报道。本研究围绕超声波在果胶酶促降解反应中的应用展开,借助化学分析方法、动力学和热力学模型、蛋白质及多糖结构分析手段,系统研究了超声波对参与酶促反应的果胶酶的改性作用、果胶底物的预处理作用及其对酶促反应过程的影响。主要研究内容如下:(1)游离果胶酶的超声辐射改性效果及机理探究通过研究不同超声波条件下果胶酶活性的变化规律发现,低强度、短时间超声波作用可提高果胶酶的活性,而过高的超声波强度或过长的处理时间都会导致果胶酶的失活。实验得到果胶酶的最适改性条件为:超声波强度4.5 WmL-1、作用时间15 min;经超声改性的果胶酶催化的水解反应速率提高,反应的活化能(Ea)、焓变(ΔH)、熵变(ΔS)、自由能变(ΔG)均降低,说明超声作用提高了果胶酶的催化活性,使酶促反应更易进行;超声波处理后,果胶酶催化效率提高、与底物之间的亲和力增强;超声波处理不改变果胶酶的最适温度,但可以提高其在20-60 ℃温度范围内的反应稳定性;果胶酶在40-60 ℃温度范围内的失活动力学可通过两相模型进行拟合,超声波处理可提高果胶酶的热稳定性;超声波处理后,果胶酶蛋白荧光强度下降,二级结构中β-折叠含量上升、无规卷曲含量下降,说明酶蛋白的空间结构变得更加整齐有序、其活性中心可能受到一定影响,超声改性作用在24h内具有不可逆性。通过研究超声波在果胶酶改性中的自由基效应和机械效应发现:超声波强度越强、作用时间越长、操作温度越低,反应体系中羟自由基含量越高,超声波自由基效应越强;浓度为4 mM的硫脲可有效屏蔽超声波空化产生的自由基效应,因此可添加到处理体系中用作自由基清除剂;果胶酶溶液的浓度不会影响最佳超声波改性条件,但酶浓度越低,果胶酶在超声波场中的改性效果越显著;在果胶酶的超声辐射改性过程中,超声波的自由基效应和机械效应都起到了一定作用,其中在酶的活化阶段,超声波的机械效应起主导作用;在酶的失活阶段,超声波的自由基效应起主导作用。(2)超声波辅助果胶酶固定化及固定化酶超声辐射改性的研究固定化果胶酶的制备通过包埋交联法进行,固定化率在海藻酸钠浓度为2%、氯化钙溶液浓度为0.15 M的条件下达到最大值;当超声波作用于果胶酶的固定化过程中时,果胶酶的固定化率在强度为9.0 W mL-1、作用时间为20 min的超声波条件下取得最大值;当超声波作用于固定化酶改性时,果胶酶的活性在强度为4.5WmL-1、作用时间为10min的超声波条件下取得最大值。固定化载体的结构在超声波作用下变得膨胀松散、凝胶基质孔径增大,使果胶酶更容易作用于果胶底物;超声波作用可提高固定化果胶酶的催化效率及其与底物间的亲和力;固定化和超声波的作用均不改变果胶酶的最适温度和最适pH,但固定化果胶酶对高温和高pH的耐受性增强,而超声波作用可增强果胶酶在每个温度和pH下的反应活性;固定化显著增强了果胶酶的热稳定性和反应稳定性,同时使其获得了重复利用性;超声波的作用略微降低了固定化果胶酶的稳定性,但消极影响较小。(3)超声波预处理果胶底物对酶促反应及其产物的影响研究选择强度为18.0 WmL-1、处理时间为30 min的超声波条件作为果胶的预处理条件;经超声波预处理后果胶的酶促降解效率及其与果胶酶之间的亲和力显著增强;超声波预处理可显著降低果胶底物的分子量、分散性系数和甲酯化度,从而为果胶酶解反应提供更适宜的底物;果胶经预处理后,其酶解产物基本结构不变,主链降解更完全,半乳糖含量提高,抗癌活性明显增强。(4)超声波和果胶酶在果胶降解中的协同效应及机理研究强度为4.5 W mL-1、处理时间为10 min的超声波条件对果胶的酶促降解促进效果最强;超声波作用于酶促反应可提高果胶酶的催化效率及其与底物之间的亲和力,并对果胶酶的结构进行了有利改性;果胶分子量的超声降解、酶促降解和超声波-果胶酶联用降解过程均符合二级动力学模型,表明三个反应中果胶的降解是随机进行的;通过定义协同性系数的概念,分别从还原糖产量增加和果胶分子量降解的角度探索了超声波和果胶酶的共同作用效果,发现二者在果胶降解过程中产生协同效应,且温度越低、协同效应越强;超声波和果胶酶的联用可显著降低果胶的甲酯化度,但可保持其乙酰化度;酶解反应和声酶解反应均通过切断果胶的同型半乳糖醛酸聚糖(HG)区域引起降解,并可较好地保留其鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG-Ⅰ)区域;超声波和果胶酶联用可完全降解果胶纳米结构中的聚合体和多分支结构,降解产物以短的线性单片段和单分支结构的形式存在。本研究的结果为改性果胶的制备提供了新的思路,并为超声波在酶促反应各个环节中的应用提供了理论基础,对于扩大超声波在食品工业中的应用范围具有重要意义。