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越来越多的流行病学证据表明,维生素D缺乏（通常被定义为血清25（OH）D＜20 ng/m L）或不足（血清25（OH）D＜30 ng/m L）与炎症性肠病（IBD）的风险增加有关,而增加维生素D的摄入量会减少IBD的患病风险。提示维生素D不足在IBD的发病过程中起着重要作用,然而其机制并不明确。研究表明肠道屏障功能异常包括肠道菌群失衡,肠道上皮紧密连接破坏等,在IBD中起着重要的作用。环境、饮食、年龄以及宿主基因缺陷诱导的肠道菌群失衡可促进有害菌数量的增加,导致大量内毒素和（或）病原微生物等通过受损肠黏膜进入体循环,诱发和加重肠道炎症。此次研究的目的是利用活性维生素D缺乏的Cyp27b1基因敲除小鼠（KO鼠）,通过16S r RNA测序技术分析活性维生素D缺乏对肠道菌群的影响,通过免疫荧光等技术检测肠道上皮细胞紧密连接蛋白的表达,探讨活性维生素D通过维持肠道屏障发挥缓解IBD的作用机制。为了明确1,25（OH）2D3的缺乏是否可导致结肠炎症,我们比较了10月龄的野生型（WT）、Cyp27b1基因敲除（KO）以及给予1,25（OH）2D3补充的KO小鼠（KO+VD）的体重、结肠长度、脾脏重量、结肠组织炎症等表型。结果显示:与WT小鼠相比,KO小鼠呈现明显的结肠炎症表型,包括体重减轻、结肠长度缩短、脾脏重量增加,结肠组织炎症细胞浸润增加,以及促炎细胞因子表达增加。但给予KO小鼠1,25（OH）2D3补充后,上述症状明显改善。这些结果说明1,25（OH）2D3缺乏能够引起小鼠结肠组织炎症,补充1,25（OH）2D3可部分缓解纠正。为了明确1,25（OH）2D3的缺乏是否会导致肠道菌群失衡,我们收集5对WT、KO小鼠的粪便,提取粪便中的细菌DNA进行16S r RNA测序,并分别在门水平和纲水平上进行比较,来确定WT和KO小鼠之间是否存在细菌组成上的差异。结果显示,虽然在alpha-多样性上KO和WT鼠并没有太大的差异,在所有样本中厚壁菌和拟杆菌均占细菌总数的主要部分,但是Beta-多样性分析发现,Akkermansia muciniphila（A.muciniphila）,一种可降解粘液蛋白的细菌在KO小鼠中的丰度远远高于WT小鼠。另外,Bacteroides-acidifaciens菌,被认为是产生短链脂肪酸的肠道细菌,则在WT小鼠中较为丰富。同时通过设计针对A.muciniphila引物的q PCR结果也进一步证实A.muciniphila菌在KO鼠中数量明显高于WT鼠,而补充1,25（OH）2D3大大降低了A.muciniphila菌的丰度。并且通过对小鼠粪便中丁酸盐的检测发现,KO小鼠中的丁酸盐含量明显低于WT,而补充1,25（OH）2D3可以部分恢复丁酸盐的含量。这些结果表明:1,25（OH）2D3的缺乏确实改变了肠道菌群的组成,特别是增加了A.muciniphila菌的丰度。为了明确1,25（OH）2D3缺乏导致A.muciniphila的增加是否影响了结肠黏膜黏液层厚度,进而使细菌容易进入肠道黏膜,加重小鼠炎症。我们利用阿里蓝染色,检测了结肠黏液层的厚度、计算结肠杯状细胞的数量,并通过q PCR检测了Muc1、Muc2、Muc3和Muc4的表达。结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠中的黏液层厚度明显降低,而1,25（OH）2D3补充可部分恢复黏液层厚度。但是结肠杯状细胞数量则在WT、KO、KO+VD小鼠中没有差异,同时q PCR结果发现KO小鼠结肠组织的Muc2,Muc4的m RNA表达要高于WT小鼠,但是Muc1和Muc3的表达则无明显差异。另外利用细菌通用引物（EUB）的q PCR检测发现KO小鼠的肠系膜淋巴结（MLNs）中的细菌表达明显高于WT小鼠。这些结果表明:1,25（OH）2D3缺乏导致的A.muciniphila丰度增加影响了结肠粘膜黏液层的厚度以及导致了肠道细菌在肠系膜淋巴结的异位。为了排除1,25（OH）2D3缺乏的KO小鼠肠道内A.muciniphila丰度的增加来自年龄因素的可能性,我们取10-12周的KO、WT小鼠的粪便提取DNA,检测A.muciniphila丰度、进行阿里蓝染色检测黏液层厚度以及q PCR检测小鼠肠系膜淋巴结（MLNs）中的细菌异位情况。结果显示,年轻的KO小鼠的粪便样本中A.muciniphila含量较高,并且细菌向MLNs的异位也增加,并且与WT小鼠相比,KO小鼠的结肠黏液层厚度变薄,但仍比10月龄的KO小鼠的黏液层厚度要厚。这些结果表明,1,25（OH）2D3缺乏导致A.muciniphila丰度增加,黏液层厚度变薄,淋巴结细菌表达量增高,是受基因影响,与年龄无关。为了明确1,25（OH）2D3缺乏是否影响小鼠结肠上皮细胞的紧密连接,我们通过免疫荧光以及Western Blotting检测了主要的连接蛋白的表达情况。结果发现:相比较WT小鼠,连接蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin4等在KO小鼠中的表达显著减少,而1,25（OH）2D3的补充则能部分纠正连接蛋白的表达。这些结果说明1,25（OH）2D3的缺乏可以通过减少细胞连接蛋白表达进而影响肠道屏障作用。本研究结果表明,活性维生素D的缺乏能够通过改变肠道菌群的组成成分,增加Akkermansia muciniphila的表达,破坏肠道黏液层;同时减少连接蛋白表达,最后导致肠道屏障的破坏,肠道通透性的增加,加速外来病原体入侵,进而促进结肠炎症的发生。本研究结果将有助于揭示活性维生素D通过调节肠道菌群和肠道上皮连接蛋白的表达在结肠炎症发生发展中的作用机制,这可能对IBD的预防提出新的研究方向和理论依据。