黑色素瘤(Melanoma)是一种起源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤,其恶性程度高﹑侵袭力强、易转移且预后差,严重威胁着人类的健康。在临床上,黑色素瘤中晚期多采用达卡巴嗪(Dacarbazine,DTIC)等化疗,但疗效不佳,远未达到人们的预期。为增强疗效,引入肿瘤营养疗法就具有重要的意义。蓝莓营养丰富,富含花青素(Blueberry anthocyanin,BA),被誉为“水果之王”。研究表明BA具有广泛的药理作用,同时BA产品常作为高档营养品被人们广泛使用。然而依据中医“药食同源”理论,营养品和药品并不能随意搭配,因此探究BA是否适用于黑色素瘤患者使用DTIC的辅助治疗具有一定的意义。基于此,本论文开展了以下几个方面的工作:(1)HPLC法测定黑色素瘤小鼠尿液中达卡巴嗪的含量本章发展了一种以混合有机溶剂/磷酸盐缓冲溶液体系为流动相的HPLC方法。结果表明DTIC在0.25μg/m L～1000μg/m L浓度范围内线性关系良好(r~2=0.999),检出限和定量限分别为0.12μg/m L和0.25μg/m L(基于信噪比S/N=3和S/N=10)。低、中、高三种浓度(50.0μg/m L、375μg/m L、500μg/m L)水平加标回收率分别为98.9%、102%、99.1%,相对标准偏差(RSDs)分别为3.2%、1.3%、1.2%(n=5)。该方法为检测尿液中DTIC含量,进而探究其在黑色素瘤C57BL/6小鼠中的利用率提供了快速检测手段。(2)BA抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的作用机制研究以黑色素瘤B16-F10细胞为研究对象,采用MTT法检测BA对B16-F10细胞增殖的影响,结果表明BA在体外可显著抑制B16-F10细胞生长并呈现剂量依赖性。通过划痕实验、Transwell侵袭实验及明胶酶谱实验表明BA可以抑制B16-F10细胞的迁移及侵袭。采用AO/EB法和流式细胞术表明BA可诱导B16-F10细胞凋亡。通过Western blotting法研究其凋亡机制,结果表明BA通过线粒体途径诱导B16-F10细胞凋亡。(3)BA作为营养品辅助DTIC治疗黑色素瘤的药理作用研究考察BA作为营养品与DTIC共同治疗黑色素瘤C57BL/6小鼠的治疗效果。根据黑色素瘤增长的速度及瘤重,可以发现辅以营养品BA后,肿瘤生长的速度较单独使用DTIC快。同时利用建立的HPLC方法检测不同时间段黑色素瘤C57BL/6小鼠尿液中DTIC含量。结果表明在黑色素瘤早期,引入BA有助于DTIC利用率增加;在黑色素瘤中晚期无明显的变化。以上结果证实DTIC的表观利用率与其实际疗效并不相符,其原因需要进一步探究。(4)BA为营养品辅助DTIC治疗黑色素瘤的作用机制研究本章采用HE染色观察BA+DTIC对黑色素瘤形态的影响,结果显示BA+DTIC组坏死区域内较多中性粒细胞浸润,坏死区域肿瘤细胞核固缩、碎裂甚至溶解。通过Ki-67免疫组化及TUNEL染色检测BA+DTIC对黑色素瘤的增殖及凋亡的影响,结果发现BA+DTIC组的Ki-67表达高于DTIC组,BA+DTIC组的凋亡率低于DTIC组。进一步采用Western blotting法检测相关蛋白研究BA引入后DTIC作用减弱的可能机制,结果表明BA可通过PI3K/AKT途径减弱DTIC对黑色素瘤的治疗作用。上述实验结果表明尽管单独使用BA对黑色素瘤可以产生一定的抑制作用,但对黑色素瘤的药效要远低于黑色素瘤常用化疗药物DTIC。更为重要的是,当作为营养品使用,BA会削弱对黑色素瘤常用化疗药物DTIC疗效。因此建议使用DTIC治疗的黑色素瘤患者,须慎重考虑BA及含有BA的产品作为营养辅助治疗。