论文部分内容阅读
喜树碱(Camptothecin,CPT)和 10-羟基喜树碱(10-hydroxycamtothecin,HCPT)是喜树中两种主要生物碱。裂环马钱子苷合成酶(SLS)和色氨酸脱羧酶(TDC)是喜树碱类衍生物生物合成过程中的两个关键酶。本文以发芽的喜树种子及喜树幼苗为研究对象,在优化10-羟基喜树碱和喜树碱含量及两种代谢关键酶活性分析方法的基础上,探讨了喜树芽苗期10-羟基喜树碱和喜树碱以及SLS和TDC活性的动态变化,同时简要分析了两种生物碱含量与两种酶活性的相关性。1.研究并确立了分析10-羟基喜树碱和喜树碱的HPLC以及LC-MS/MS方法。(1)确定了用于分析10-羟基喜树碱和喜树碱的喜树样品制备方法。喜树材料80℃烘干粉碎,以质量浓度55%的乙醇为溶剂进行超声提取,提取条件:液固比25:1(mL:g),提取时间60min,超声频率40kHz,提取温度40℃。(2)确定了 10-羟基喜树碱和喜树碱测定的HPLC方法。色谱柱:HiQ SiL C18色谱柱(4.6mmΦ×250mm,5μm);流动相:乙腈-水(3:7/V:V);流速:1.0mL/min;检测波长:254nm(喜树碱)和366nm(10-羟基喜树碱);柱温:25℃;进样量:10μL。(3)确定了 10-羟基喜树碱和喜树碱测定的LC/MS/MS方法。色谱条件:流动相为含有 0.2%甲酸的水-甲醇(1:1,v/v);色谱柱为 Symmetry Shield TM RP18 column(3.9 mmΦ×150 mm,5μm);流速为1.0 mL/min(分流比7:3)。质谱条件:电喷雾源正离子模式;离子源温度300℃;,电离电压5500V;检测方式:多反应选择监测(MRM),用于定量分析的离子反应为m/z 365.3/321.1(10-羟基喜树碱)和m/z349.3/305.3(喜树碱)。2.确定了裂环马钱子苷合成酶(SLS)活性和色氨酸脱羧酶(TDC)活性测定方法。裂环马钱子苷合成酶(SLS)活性以制备酶液添加马钱子苷后,单位时间内裂环马钱子苷的生成量表征酶活性,用μmol·g-1(FW)·h-1表示。其中裂环马钱子苷以内标法定量。液相条件:色谱柱为HiQ SiL C18色谱柱(4.6mmΦ×250mm,5μm);流动相为乙腈-水(40分钟内,乙腈体积百分数从15%升至35%);流速为0.5mL/min;检测波长:240 nm;柱温为25℃;进样量为10 μL;内标物:7-羟基-6-甲氧基香豆素。色氨酸脱羧酶(TDC)活性以制备酶液添加色氨酸后,单位时间内色胺的生成量表征酶活性,用μmol·g-1(FW)·h-1表示。其中色胺以内标法定量。液相条件:色谱柱为HiQ SiL C18 色谱柱(4.6mmΦ×250mm,5μm);流动相为甲醇-10 mM KH2P04 水溶液(V:V/7:3,含 7 mM SDS);流速为 1.0 mL/min;检测波长:280 nm;柱温为 25℃;进样量为10μL;内标物:5-甲基色胺。3.对喜树芽苗期主要生物碱含量及相关酶活性进行了相关分析。种子萌发过程中,10-羟基喜树碱含量与SLS活性呈显著正相关;喜树碱含量与TDC活性呈正相关;10-羟基喜树碱含量与TDC活性、喜树碱与SLS活性呈负相关。喜树幼苗发育过程中,叶片中两种生物碱(CPT、HCPT)与TDC活性呈负相关;叶片中两种生物碱(CPT、HCPT)与SLS活性、茎根两种生物碱与SLS及TDC活性均呈正相关。本文的研究结果将为研究喜树碱类物质代谢和开发喜树资源提供一定的基础数据。