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我国于上世纪80年代开展液态发酵醋生产,2008年产量已达到100万吨(以60g L-1醋酸计)。相比于国外,我国液态发酵醋的生产效率和产量都不高。究其根源是对发酵用的菌种、工艺等的研究较少,尤其是对工业用菌缺乏深入的研究,如发酵菌种改良、发酵动力学、耐酸机理等方面。本研究针对上述问题,对我国一株工业用菌沪酿1.01进行研究,结合发酵动力学和相关代谢研究寻求更适合其自身特点的发酵工艺,利用诱变得到的醋酸高产菌尝试高酸度醋发酵,分析高酸度醋发酵中能量代谢的调节特点,并提出发酵中巴氏醋杆菌可能使用的耐酸协同机制。主要研究如下:(1)基于醋杆菌沪酿1.01发酵动力学研究的发酵优化根据16s rRNA基因同源性比对和生化特征,鉴定出实验用工业菌株为巴氏醋杆菌种的一个亚种,命名为Acetobacter pasteurianus CICIM B7003。对于该菌株,初始乙醇浓度超过48g L-1时会抑制生长,初始乙酸超过40g L-1时细菌将大量死亡,因而重复补料分批发酵的分割比定为总发酵体积的43%(v/v)。结果显示重复补料分批培养模式明显优于分批模式,该模式下平均产酸速率为1.80±0.01g L-1h-1,醋酸转化率在90.73%左右。在动力学研究的基础上,引入“氧气消耗对醋酸积累的化学计量系数”,评价醋酸发酵中菌对氧气的利用效率。根据该系数计算最优通气速率,调整通气速率从54L h-1(0.15vvm)降到43L h-1(0.12vvm),通气优化后的醋酸转化率达到93.36%。(2)强化乙醇呼吸链运行,促进醋酸发酵用液质联用分析得知A. pasteurianus CICIM B7003呼吸链中的辅酶Q种类为Q9。基于基因序列同源性确定该菌乙醇呼吸链中的乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和末端氧化酶种类与A. pasteurianu IFO3283-01基本一致。在乙醇呼吸链酶系研究的基础上,研究得知重复补料分批发酵过程中产酸速率与乙醇呼吸链酶系的活性呈正相关。通过添加组成乙醇呼吸链的酶和辅酶的前体,提高通气速率,提升了产酸速率,平均产酸速率达到2.29±0.02g L-1h-1,比优化前提高了27.8%。(3)酸激复合紫外诱变选育醋酸高产菌及高酸发酵探索诱变前用亚致死剂量的醋酸(50g L-1)胁迫1h,诱导细胞对醋酸的“同源抗性”,增强细胞对诱变环境中的适应性,淘汰低耐酸个体。之后将醋酸胁迫处理过并富集培养的细胞进行紫外诱变并辅以醋酸酸激(60g L-1),筛选得到一株醋酸高产菌A.pasteurianus CICIM B7003-02,该菌能耐受60g L-1的初始醋酸,最大产酸量达到103g L-1,且连续转接12次醋酸产量稳定。用该突变株在9L自吸式发酵罐中成功进行重复补料分批发酵,发酵采用两阶段通气策略提高了醋酸转化率,发酵终了酸度达到93g L-1,平均产酸速率为1.83±0.01g L-1h-1,转化率升到93.97±0.16%。(4)高产突变菌能量代谢与醋酸产生能力的关系研究A. pasteurianus CICIM B7003-02(突变菌)对发酵中的醋酸胁迫在细胞形态、生理、基因转录及能量调节方面的响应,提出巴氏醋杆菌在醋酸发酵中可能使用的耐酸协同机制模型。醋酸发酵过程中突变菌的多糖占细胞干重百分比由最初2.5%下降到0.89%,细胞膜不饱和脂肪酸占膜总脂肪酸含量由21.57%提高到47.91%。随醋酸积累突变株耐酸蛋白合成相关基因(grpE、dnaK、aatA)的转录水平显著提高,提升了细胞对酸性环境的抗性。此外,乙醇呼吸链酶系和ATPase活性在发酵中也明显提高,为抵御醋酸胁迫提供能量。进一步对高酸发酵中突变株的能量代谢分析得知,发酵初期菌体主要通过苹果酸/琥珀酸回补偶联有氧呼吸途径产能。进入醋酸快速积累阶段,乙醇呼吸链为主要供能代谢途径。发酵后期苹果酸/琥珀酸回补途径配合乙醇呼吸链供能。基于上述研究,采取添加琥珀酸和苹果酸强化前期细胞能量水平,提升高酸度醋发酵的产酸速率。综合分析后,提出巴氏醋杆菌在醋酸发酵中可能使用的耐酸协同机制模型。