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目的丙烯酰胺(ACR)是一种用途广泛的工业毒物。它是一种神经毒性物质和人类可能致癌物,它的神经毒性主要表现为中枢-周围性远端轴索病,临床表现为共济失调、骨骼肌无力,其病理特征是远端轴突肿胀、变性、神经丝(neurofilament,NF)聚集：我们前面的研究发现,ACR中毒大鼠坐骨神经组织中NFs(包括NF-L、NF-M和NF-H)的含量均是下降的。但其神经毒性的作用机制仍未完全阐明。基于ACR中毒NFs及其超微结构的改变,为进一步探讨ACR中毒性外周神经病变发生的分子机制,我们建立了ACR亚慢性中毒大鼠模型,测定了坐骨神经中与NFs磷酸化有关的三种蛋白激酶：蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和细胞周期依赖性蛋白激酶5 (CDK5),及其相关蛋白包括钙调蛋白(CaM)、环磷腺苷(cAMP)、CDK5的两个激活因子P35和P25的变化。此外还对血清PKA和PKC的含量进行了分析,以期为ACR神经损伤生物标志物的探索提供依据。方法1.成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、低剂量组和高剂量组。低、高剂量组分别以20 mg/kg体重和40 mg/kg体重剂量腹腔注射ACR染毒,每周3次,连续8周；对照组腹腔注射等体积双蒸水。2.神经行为的改变和步态评分密切观察各组大鼠的一般状况和神经行为的改变,测量大鼠体重,给出步态评分。3.分离坐骨神经组织,匀浆后超速离心,取上清-80℃保存备用。用SDS-PAGE和Western Blotting方法测定PKA、PKC、CDK、P35和P25蛋白含量；用ELISA试剂盒测定CaM和cAMP的含量。4.取大鼠坐骨神经组织匀浆上清,利用放射性同位素技术研究ACR染毒对大鼠神经组织中PKA和PKC活性的影响。5.断头取血,常规分离血清,利用SDS-PAGE和Western Blotting方法测定血清中PKA和PKC的含量。结果1.体重结果与中毒表现：与对照组相比,ACR染毒组大鼠体重减轻,高剂量组第5-8周体重下降(P<0.05)。高剂量组大鼠在染毒第8周后肢完全瘫痪,走路时后肢后拖,足背着地,无法支撑身体,步态得分增高；染毒终止时,低、高剂量组分别呈轻度和重度受损步态。与对照组比较,ACR染毒组大鼠步态评分增高,低剂量组第8周出现增高(P<0.01),高剂量组第4-8周出现增高(P<0.01)。2.蛋白测定结果：与对照组相比,低剂量组和高剂量组坐骨神经中的蛋白激酶及其相关蛋白都发生了不同程度的变化。(1)坐骨神经中CaM含量的变化：与对照组相比,低剂量组无明显变化,高剂量组增高了50%(P<0.01)；与低剂量组相比,高剂量组升高了50%(P<0.01)。(2)坐骨神经中cAMP含量的变化：cAMP蛋白含量在ACR亚慢性中毒大鼠坐骨神经中明显降低,与对照相比,cAMP在低剂量组降低了11%,在高剂量组降低了95%(P<0.01)；与低剂量组相比,cAMP在高剂量组降低了94%(P<0.01)。(3)坐骨神经中PKA和PKC的含量及活性的变化：与对照组相比,PKA和PKC的含量在低剂量组分别升高了18%和21%,在高剂量组分别增高了73%(P<0.01)和170%(P<0.01)；与低剂量组相比,这两者的含量在高剂量组分别升高了46%(P<0.01)和125%(P<0.01)。PKA活性与对照组相比,低剂量组增高了60%(P<0.01),高剂量组降低了50%(P<0.01)；与低剂量组相比,高剂量组降低了220%(P<0.01)。PKC活性与对照组相比,低剂量组增高了50%,高剂量组增高了6倍(P<0.01)；与低剂量组相比,高剂量组增高了3倍(P<0.01)。(4)坐骨神经中CDK5、P25和P35含量的变化：与对照组相比,CDK5在低剂量组降低了51%(P<0.01),高剂量组降低了22%(P<0.05)；与低剂量组相比,高剂量组升高了59%(P<0.01)。P25和P35含量与对照组相比,低剂量组分别降低了10%和21%(P<0.01),高剂量组分别降低了77%(P<0.01)和82%(P<0.01)；与低剂量组相比,高剂量组分别降低了74%(P<0.01)和77%(P<0.01)。(5)血清中PKC和PKA的含量与对照组相比,低剂量组分别升高了6%和6%,高剂量组分别升高了45%(P<0.01)和55%(P<0.01)；与低剂量组相比,高剂量组分别升高了37%(P<0.01)和47%(P<0.01)。结论1.ACR亚慢性染毒可以引起神经系统损伤,表现为大鼠步态评分异常。2.ACR染毒可明显升高坐骨神经组织中CaM含量,说明ACR可明显增加细胞内Ca2+浓度。3.坐骨神经中蛋白激酶的变化可能与ACR的周围神经毒性有关,表现为ACR亚慢染毒可明显改变坐骨神经中cAMP、PKA、PKC、CDK5、P35和P25蛋白的含量以及PKA和PKC的活性,从而导致NFs磷酸化状态变化。4.血清中PKC和PKA有可能作为ACR神经病变的生物效应标志物,表现为ACR亚慢性染毒可引起大鼠血清中PKC和PKA相对含量改变。5.ACR的周围神经毒性作用机制可能与上述蛋白的变化相关。