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背景pten(Phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome 10)人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因,位于10q23.3,转录产物为515 kb m RNA,属于PTP(protein tyrosine phosphatases)基因家族成员。自1997年PTEN蛋白作为抑癌因子被发现以来,受到世界各地研究者的广泛关注,在目前已有的研究中,PTEN作为一个双重特性的磷酸酶,同时具有脂质和蛋白磷酸酶特性。它的脂质磷酸酶活性能够将PI3K信号通路中的PIP3水解成为PIP2,从而阻断该信号通路,降低下游AKT的活化,减少了细胞的恶性增生。另外,PTEN还具有蛋白磷酸酶活性,它主要作用于底物蛋白的丝、苏氨酸及酪氨酸位点。在大多数癌细胞中,许多关键基因产物磷酸化水平都是不正常的,PTEN能够去磷酸化这些蛋白而显示抑癌作用。目前,PTEN作为研究比较火热的一个抑癌基因,许多生物学功能还不是了解的特别清楚,例如:PTEN除了起磷酸酶作用外,一部分研究表明,PTEN在细胞核内似乎有维持染色体稳定的功能。另外,PTEN-Long作为PTEN的一个翻译变异体,选择PTEN起始翻译位点前519位的CTG作为起始位点开始翻译,形成了比经典PTEN多173个氨基酸的蛋白,该蛋白可被细胞分泌出细胞膜,穿梭进入并作用于临近细胞。这使得它不同于经典PTEN,吸引了许多临床研究工作者的兴趣。PTEN-Long同经典PTEN一样具有脂质磷酸酶活性,能够抑制PI3K信号通路,经过分泌和穿梭后,实现远距离调控临近细胞的生长、凋亡等活动。在已有的研究中,PTEN的缺失与异常往往与肿瘤的发生发展有密切的关系,许多文献和报道表明PTEN在多种散发性癌症和两种常染色体显性遗传的错构瘤综合征中突变。传统意义上的治疗致力于完全恢复PTEN基因的表达,但这通常很难实现的。现在我们可以利用PTEN-Long出入细胞膜的功能,同时采用一些靶向治疗手段,将PTEN-Long精准定位并有效作用于癌细胞,这将是未来临床治疗的一个方向。目的本课题通过研究分泌型蛋白PTEN-Long表达载体的构建和大量表达的方法,系统验证了PTEN-Long对癌细胞的抑制作用,这对于我们深入认识PTEN及PTEN-Long表达的调控新机制有益,而且该研究在肿瘤临床治疗方面具有潜在的应用市场。方法构建表达PTEN-Long的载体,大量表达并纯化该蛋白。同时,包装PTEN过表达以及空载体对照慢病毒。利用包装好的PTEN过表达和空载体对照慢病毒常规方法感染U87细胞,形成PTEN稳定过表达以及对照的U87细胞系,并用Western blot验证阳性细胞株。利用获得的PTEN过表达U87稳定细胞株作为阳性对照,在PTEN缺陷表达的野生型U87中直接加入纯化好的PTEN-Long蛋白,验证其细胞生物学功能。结果1.成功构建PTEN-Long原核载体,蛋白诱导表达目前正在优化表达条件。2.成功构建PTEN-Long真核表达载体并成功表达及纯化。3.在PTEN天然缺失的U87细胞中,加入PTEN-Long处理之后,同经典PTEN作用相似,观察到PTEN-Long对于细胞增殖生长以及迁移侵袭都有抑制作用。结论1.成功构建PTEN-Long载体,与6×His融合蛋白能够成功表达并进行蛋白纯化。2.PTEN-Long同PTEN作用相同,能够抑制肿瘤细胞生长、迁移和侵袭。