【摘 要】
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禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的主要表现为呼吸道、生殖道损伤和免疫力、产蛋率下降等多种临床症候群的接触性传染病。禽流感病毒是一种负链RNA病毒
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禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的主要表现为呼吸道、生殖道损伤和免疫力、产蛋率下降等多种临床症候群的接触性传染病。禽流感病毒是一种负链RNA病毒,属于正黏病毒科A型流感病毒属,根据致病力大小可分为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)两大类。H9亚型禽流感属于LPAI,但其感染宿主广泛,感染率较高,往往造成很大的经济损失。血凝素(Hemagglutinin,HA)是禽流感病毒最为重要的表面蛋白之一,是重要的保护性抗原,也是构建DNA疫苗的首选基因。本研究以分离鸭源H9亚型毒株的全长HA基因与真核表达载体pVAX1构建pVAX1-HA DNA疫苗,采用活体电击方法在小鼠、鸡和鸭上进行DNA疫苗的免疫效果评价,并探究DNA疫苗与灭活苗联合使用对免疫效果的影响。1.从鸭样品中分离出的病毒经RT-PCR扩增出HA基因片段,并对其进行测序及遗传进化分析,结果显示该分离毒株为H9亚型禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGL,符合低致病性禽流感病毒特征。将HA基因克隆至pVAX1得到pVAX1-HA真核表达质粒,转染至293T细胞后,经Western Blotting检测HA蛋白的表达水平。结果表明,pVAX1-HA真核表达质粒构建成功,且在293T细胞上正确表达出HA蛋白,大小与预期蛋白分子量相一致。2.将BALB/c雌性小鼠随机分为5组,分别为DNA疫苗组、DNA疫苗和灭活疫苗联合组、灭活疫苗(免疫1次)组、灭活疫苗(免疫2次)组和空白对照组。DNA疫苗采用电击方法免疫,电击条件为60 V 10 ms 6个脉冲,免疫剂量为100μg/只;灭活疫苗直接注射腿部肌肉,免疫剂量为0.2 mL/只。隔3周以相同的条件进行加强免疫,每次免疫后两周采血,采用HI试验检测抗体水平,利用试剂盒检测IL-4、IL-6和IFN-γ的浓度。结果表明DNA疫苗免疫小鼠后,能够更好地诱发机体产生免疫细胞因子,刺激机体的细胞免疫应答。DNA疫苗组抗体水平逐步上升,经过3次免疫后小鼠的抗体水平较高(8.3 log 2),在第8周时,联合组抗体水平(8.8 log 2)与灭活疫苗组(9.5log 2)相当,但联合组抗体水平能维持半年之久。试验表明本DNA疫苗具备良好的免疫效果,且与灭活疫苗联用时,可使抗体水平持续时间更长。3.将鸭随机分为5组,分别为DNA疫苗低剂量组(50μg/只)和高剂量组(100μg/只)、DNA疫苗首免+灭活苗组、灭活苗组和空白对照组。DNA疫苗和灭活苗的免疫方法同小鼠试验。隔3周以相同的条件免疫,连续免疫3次。结果为DNA疫苗组抗体水平在3免后两周均达到高峰,抗体水平分别为5.1 log 2(高剂量组)和4 log 2(低剂量组),随后持续较高水平;在2免后两周DNA疫苗首免+灭活苗组的抗体水平(10.5log 2)与灭活疫苗组(11 log 2)相当,但在3免后8周抗体水平比灭活疫苗组略高并呈上升趋势,而灭活疫苗组略有下降。结果表明DNA疫苗单独使用可刺激机体产生较好的免疫效果,免疫剂量大抗体水平高,但未达到灭活苗的免疫效果。
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