论文部分内容阅读
肿瘤干细胞的起源通常认为是来源于一个正常的干细胞，他们拥有类似的生物学特性，是肿瘤抗药性、肿瘤转移和复发的潜在原因。CD105、CD90是国际细胞疗法协会(International Society for Cellular Therapy, ISCT)对于骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的鉴定标准，越来越多的研究已经证实骨髓间充质干细胞具有趋向原发性和转移性肿瘤部位的特性。CD105是判断乳腺癌预后的一个独立的因素，若肿瘤细胞高表达CD105，那么病人的无病生存率和总生存率均较低，在转移性乳腺癌中，CD105可能会是一个生物治疗的有效靶点。Yang等在2008年的Cancer Cell杂志中研究显示CD90有可能对于肝癌干细胞候选标志物具有重要意义。近些年的研究热点上皮细胞间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)可能在肿瘤的发生中一直发挥作用，EMT的诱导因子TWIST1和SNAIL1经常在乳腺原位导管癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)中被检测到，而表达TWIST1的管腔型乳腺上皮细胞可以促使乳腺癌的发生。近年研究发现EMT诱导过程赋予了细胞类干细胞样的特性，加之CD105联合CD90可作为间充质干细胞的标记物已被广泛接受，因此我们考虑了这两种标记物与EMT进而与乳腺癌的转移之间的关系。
目的:本研究选取人乳腺癌高骨转移性细胞系MDA-MB-231，利用CD105和CD90两个细胞表面标记物运用流式细胞仪分选从亲代细胞中尝试富集一群“类间充质”表型的细胞，通过观察各细胞亚群的增殖能力，进行Transwell迁徙实验，以及对干细胞相关基因检测，研究它们是否具有干细胞特性，探寻乳腺癌干细胞与EMT的相关性，为乳腺癌复发与转移的机理研究并为肿瘤干细胞理论奠定基础。
方法:干细胞具有慢周期性、未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。本研究选取人乳腺癌高骨转移性细胞系MDA-MB-231进行研究。
1.将处于对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，经CD105-RPE、CD90-FITC抗体标记后，运用流式细胞仪检测其分别在MDA-MB-231细胞中的表达概率，并分选得到CD105+/CD90+、CD105-/CD90-两组细胞亚群。
2.分选后分别培养CD105+/CD90+双阳性亚群、CD105-/CD90-双阴性亚群和MDA-MB-231亲代细胞（亲代细胞群）三个不同群体细胞，当其处于对数生长期时，在96孔培养板内培养初始浓度相同的各组细胞，比较观察CD105+/CD90+、CD105-/CD90-组和MDA-MB-231细胞混合群体三组细胞群的增殖能力。应用SRB法，检测在细胞贴壁后9天内的不同时间点的细胞数量，做出生长曲线。
3.细胞迁徙实验将处于对数生长期的三组细胞群，应用Transwell迁徙实验比较各细胞群的迁徙能力。
4.细胞周期检测干细胞具有慢周期性，包含更多的静止期细胞。运用流式细胞仪检测三组细胞群的细胞周期，比较G0/G1期、S期及G2/M期在各细胞群中是否具有差异。
5.各细胞群的干细胞特性基因检测应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Quantitative real-time PCR方法检测oct3/4(octamer-binding transcription factor-4), nanog, sox2(SRY-related high-mobility-group-boxprotein-2)，klf4(kruppel-like factor-4)4种胚胎干细胞特有基因的表达。实时荧光定量PCR数据用7500 version2.0.6软件分析。
6.所有数据结果用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料多组间比较采用单因素的方差分析或Kruskal-Wallis H检验，每两组间比较采用LSD检验，实验结果用(x)±s表示。计数资料采用卡方检验（x2检验），检验结果以P＜0.05认为有统计学意义(P*＜0.05，P**＜0.01）。
结果:
1.将处于对数生长期的乳腺癌，经CD105-RPE、CD90-FITC抗体标记后。使用流式细胞仪检测出MDA-MB-231细胞总群体中CD105阳性率为4.93％，CD90阳性率为3.31％，表达CD105+/CD90+双阳性概率为0.99％，表达CD105-/CD90-双阴性概率为90.77％。
2.双阳性亚群、双阴亚群组、亲代细胞群的生长曲线显示:9天内的各个时间点双阳性细胞增殖速度明显较亲代细胞群和双阴性亚群快。
3.Transwell迁徙实验结果显示:三组细胞分别培养于Transwell上室后，培养后12小时观察穿过聚碳酯膜的细胞数（用均数±标准差表示）:双阳性亚群为3.4000±0.96609;亲代细胞群为1.9000±1.19722;双阴性亚群为1.2000±0.91894。统计分析表明双阳性亚群较亲代细胞群和双阴性亚群的穿膜细胞多，(P＜0.05);亲代细胞群和双阴性亚群比较穿过膜的细胞数量没有统计学差异(P＞0.05)。
24小时观察穿过聚碳酯膜的细胞数:双阳性亚群为7.7000±1.63639，亲代细胞群为4.3000±0.82327，双阴性亚群为2.9000±0.91894。统计分析结果表明:双阳性亚群细胞较亲代细胞群和双阴性亚群的穿膜细胞多(P＜0.05)，亲代细胞群比双阴性亚群的穿膜细胞多(P＜0.05)。
将三种细胞分别于Transwell上室培养72小时，观察细胞穿过聚碳酯膜进入下室后贴壁生长情况。计数贴壁细胞:双阳性亚群为44.0000±3.60555，亲代细胞群为10.0000±2.64575，双阴性亚群为7.3333±1.52753。方差分析显示:双阳性亚群较亲代细胞群和双阴性亚群的穿膜后贴壁细胞多(P＜0.01)，亲代细胞群与双阴性亚群细胞进入下室的贴壁细胞数比较无统计学意义（P＞0.05）。
4.三组细胞的细胞周期检测:双阳性亚群细胞的G0/G1期占50.7％±1.58％，S期占27.3％±2.54％，G2/M期占22％±1.76％，双阴性亚群细胞G0/G1期占43.6％±1.62％， S期占42.2％±2.21％，G2/M期占14.1％±1.37％，亲代细胞群细胞G0/G1期占48.2％±2.14％，S期占38.2％±2.81％，G2/M期占13.6％±1.43％。比较G0/G1期在各组细胞周期中的构成比，双阳性亚群与双阴性亚群比较:x2=110.990; P＜0.01;双阳性亚群与亲代细胞群比较:x2=38.591;P＜0.01;亲代细胞群与双阴性亚群比较:x2=4.385; P＜0.01;结果分析:双阳性亚群有更多的细胞处于G0/G1期，干细胞具有慢周期性，包含更多的静止期细胞。我们推论CD105+/CD90+双阳性亚群可能具有类干细胞特性。
5.RT-PCR结果:
统计分析三组细胞群体的各干细胞特性基因表达结果如下:oct3/4检测结果:双阳性亚群为0.300839±0.0003259，双阴性亚群为0.104273±0.0004666，亲代细胞群为0.167838±0.0001645。方差分析比较三个细胞群间F=257988.7，P＜0.01，两两比较LSD法分析显示双阳性亚群oct3/4基因表达最高，亲代细胞群的次之，双阴性亚群表达最低。nanog检测结果:双阳性亚群为0.741022±0.0004544，双阴性亚群为0.279969±0.0008109，亲代细胞群为0.571277±0.0004220。方差分析比较三个细胞群间F=469563.0，P＜0.01，两两比较LSD法分析显示双阳性亚群nanog基因表达最高，亲代细胞群的表达次之，双阴性亚群表达最低。sox2检测结果:双阳性亚群为0.574776±0.0002915;双阴性亚群为0.478683±0.000200538，亲代细胞群为0.553225±0.0002452;方差分析比较三个细胞群F=123480.3，P＜0.01，两两比较LSD法分析表明双阳性亚群的sox2基因表达最高，亲代细胞群表达次之，双阴性亚群表达最低。klf4检测结果:双阳性亚群为0.603706±0.0003567;双阴性亚群为0.093214±0.0001857，亲代细胞群为0.371799±0.0001921，方差分析比较三个细胞群F=2959712.0，P＜0.01，两两比较LSD法分析表明双阳性亚群的klf4基因表达最高，亲代细胞群表达次之，双阴性亚群表达最低。
6.Quantitative real-time PCR结果:oct3/4基因在双阳性亚群细胞中检测到荧光时的循环平均数CTmean值为27.327±0.05，亲代细胞群为26.004±0.11，双阴性亚群为23.617±0.09。双阳性亚群细胞oct3/4基因的表达水平分别是亲代细胞群、双阴性细胞群的2.448、2.517倍(P＜0.05）;
nanog基因在双阳性亚群细胞中检测到荧光时循环的平均数CTmean值为29.805±0.04，亲代细胞群为25.698±0.11，双阴性亚群为27.923±0.10。双阳性亚群细胞nanog基因的表达水平分别是亲代细胞群、双阴性亚群的1.657、1.909倍(P＜0.05）;
sox2基因在双阳性亚群细胞中检测到荧光时循环的平均数CTmean值为27.159±0.04，亲代细胞群为25.104±0.12，双阴性亚群为22.686±0.13。双阳性亚群细胞sox-2基因的表达水平分别是亲代细胞群、双阴性亚群的1.460、1.481倍(P＜0.05);
klf4基因在双阳性亚群细胞中检测到荧光时循环的平均数CTmean值为27.977±0.03，亲代细胞群体为25.983±0.12，双阴性亚群为26.236±0.15。通过计算power值，双阳性亚群细胞klf4基因的表达水平分别是亲代细胞群、双阴性亚群的1.817、8.494倍(P＜0.05）。
结论:
1、CD105和CD90与乳腺癌MDA-MB-231细胞系中干细胞相关。
2、乳腺癌MDA-MB-231细胞中CD105+/CD90+的细胞亚群具有“类间充质干细胞”的特性。