论文部分内容阅读
黑曲霉是丝状真菌中曲霉属的一种,具有卓越的蛋白表达和分泌能力,能够正确进行蛋白质的各种翻译修饰,安全性广泛为人们所接受,是建立新型重组蛋白表达系统的理想选择。本课题组前期建立了食品级的黑曲霉分泌表达系统,并通过使用强启动子Pgla A6R和高效分泌信号肽Sgla A有效提高了α-淀粉酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶等重组蛋白的产量。但是,在过表达脯氨酰内肽酶、酸性蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶的研究中发现,使用强启动子Pgla A6R和高效分泌信号肽Sgla A后,目的蛋白的表达量有所下降,并且出现了菌体生长抑制现象。推测可能是重组蛋白过度表达导致错误折叠,引发了非折叠蛋白响应。本实验以过表达α-淀粉酶、脯氨酰内肽酶的黑曲霉TH-2为材料,尝试通过改变发酵培养基中葡萄糖和木糖比例、添加蛋白分泌促进剂CPPs和内质网应激抑制剂TUDCA调控目的蛋白的表达、折叠和分泌。分析发酵条件对不同菌株中相同或不同分泌蛋白表达的调控规律。研究结果将深化对黑曲霉分泌蛋白表达调控的认识,为通过优化发酵条件提高重组蛋白的分泌表达量提供有价值的参考。获取的主要研究成果如下:(1)过表达融合Flag标签的α-淀粉酶黑曲霉的构建构建了融合Flag标签的内源α-淀粉酶基因amyAF的黑曲霉表达载体pSZHG6R-amyAF,以强启动子Pgla A6R和Sgla A信号肽调控amyAF基因的表达;采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得amyAF基因表达框整合在gla A基因位点的重组菌株G1A。重组菌株G1A发酵第11 d产α-淀粉酶达到最大值,为129.18 U/m L,是出发菌株TH-2的1.85倍,与之前过表达未融合Flag标签的α-淀粉酶纯合黑曲霉重组菌株(?gla A::amy A in A.niger TH-2))所测酶活结果差距不大。(2)过表达α-淀粉酶黑曲霉的发酵调控对重组菌株G1A进行摇瓶发酵培养,设置10%木糖、2%葡萄糖+8%木糖、4%葡萄糖+6%木糖、6%葡萄糖+4%木糖、8%葡萄糖+2%木糖、10%葡萄糖、10%葡萄糖+1%CPPs及10%葡萄糖+0.01%TUDCA等8种不同的发酵培养基,取摇瓶发酵第4 d的样品进行检测分析。荧光定量PCR检测结果表明,与10%葡萄糖的发酵培养基相比,在添加木糖的培养基中,除6%葡萄糖+4%木糖的培养基中amy A基因的转录水平没有显著变化外,其他均显著降低,但最大降幅只有53%;而xyn B基因的转录水平增加了4.24-120.35倍,说明添加木糖对amy A基因的转录水平调控作用有限,而对xyn B基因的转录水平调控作用较大。添加1%CPPs后,淀粉酶基因amy A转录水平下降35%,木聚糖酶基因xyn B转录水平下降30%,内质网折叠相关基因bip A转录水平增加了0.22倍,pdi A基因转录水平增加了0.40倍。添加0.01%TUDCA后,淀粉酶基因amy A转录水平下降67%,木聚糖酶基因xyn B转录水平下降92%,bip A基因转录水平增加了3.50倍,pdi A基因转录水平增加了2.60倍。SDS-PAGE和WB检测结果表明,添加木糖后G1A菌株中木糖酶系蛋白量增加。在培养基中加入1%CPPs或0.01%TUDCA后,胞内可溶蛋白和胞内不溶蛋白都显著降低。酶活检测结果表明,不同配比的葡萄糖和木糖对α-淀粉酶的影响较小,添加1%CPPs或0.01%TUDCA对α-淀粉酶的酶活没有显著影响。这一结果明显与转录水平不一致,说明α-淀粉酶的分泌表达存在转录之后的调控。G1A菌株中木聚糖酶的表达量随着添加的木糖比例增加而逐渐提高,木糖含量为8%时,诱导表达的木聚糖酶的酶活最高,是10%葡萄糖的3.2倍。这一结果与转录水平的趋势基本一致,但差异倍数较小,说明存在转录之后的调控。(3)过表达脯氨酰内肽酶黑曲霉的发酵调控对重组菌株G1P进行摇瓶发酵培养,设置10%木糖、2%葡萄糖+8%木糖、4%葡萄糖+6%木糖、6%葡萄糖+4%木糖、8%葡萄糖+2%木糖、10%葡萄糖、10%葡萄糖+1%CPPs及10%葡萄糖+0.01%TUDCA等8种不同的发酵培养基,取摇瓶发酵第4 d的样品进行检测分析。荧光定量PCR检测结果表明,与10%葡萄糖培养基相比,在添加木糖的培养基中,除添加10%木糖发酵培养基中prot A基因的转录水平显著降低(47%)外,其他比例变化均不显著。xyn B基因的转录水平增加约31.74-53.01倍,说明添加木糖后对prot A基因的转录调控作用不大,而对xyn B基因的转录水平调控作用较大。添加1%CPPs后,脯氨酰内肽酶基因prot A转录水平增加了1.32倍,木聚糖酶基因xyn B转录水平增加了4.66倍,内质网折叠相关基因bip A转录水平增加了1.59倍,pdi A基因转录水平增加了3.89倍。添加0.01%TUDCA后,prot A基因转录水平增加了0.67倍,xyn B基因转录水平降低58%,bip A基因转录水平降低67%,pdi A基因转录水平降低62%。以碳源为10%葡萄糖作为基准,8%葡萄糖+2%木糖培养基中脯氨酰内肽酶的酶活增加了0.67倍,10%木糖培养基中脯氨酰内肽酶的酶活降低了46%,其他碳源比例对脯氨酰内肽酶的表达量影响不大。添加1%CPPs和0.01%TUDCA,脯氨酰内肽酶的酶活分别增加了0.43和0.24倍,与转录水平结果趋势一致。以上结果表明改变发酵培养基中葡萄糖和木糖比例、添加CPPs和TUDCA对重组菌株G1P中脯氨酰内肽酶的分泌表达有促进作用,这与对重组菌株G1A中α-淀粉酶的表达影响有所不同,可能是重组菌株G1P中过表达脯氨酰内肽酶导致了折叠和转运障碍,而改变碳源、添加CPPs和TUDCA可降低这一影响。G1P菌株中木聚糖酶酶活随着木糖比例的增加而逐渐提高,当木糖含量为8%时,木聚糖酶酶活最高,约是10%葡萄糖的5.86倍。这一结果与转录水平的趋势基本一致,但差异倍数较小,说明存在转录之后的调控。G1P菌株中木聚糖酶表达结果与G1A菌株中的趋势基本一致。