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研究目的在新型串联亲和纯化标签e Xact-6×His的基础上发展一种新型的串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)方案,并用此方法检测树突状细胞中Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白。对蛋白复合物进行分析鉴定及相互作用的验证,为进一步阐述Rab40b和Rab40c蛋白复合物的生物学功能及其作用机制奠定基础。研究背景树突状细胞(dendritic cell,DC)是专职抗原递呈细胞,在免疫过程中精确调节膜转运事件。Rab蛋白在天然免疫过程中系统整合一系列复杂的膜转运过程,起到重要调节作用。哺乳细胞内有70多种Rab蛋白,分别参与特定的囊泡转运途径。非洲爪蟾Rab40亚家族可以调节非经典Wnt通路,而Wnt通路对树突状细胞的分化具有重要影响。因此对Rab40亚家族的研究可以为阐述Wnt通路调控树突状细胞功能奠定基础。蛋白大分子通过形成蛋白复合物来执行生物学功能,蛋白质蛋白质相互作用(protein protein interaction,PPI)是研究蛋白质功能的重要方法。目前蛋白相互作用研究技术各有优劣,其中应用广泛的串联亲和纯化质谱也有其限制。因此在应用高效的串联亲和纯化技术上,对Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白的研究不仅对阐述Rab40b和Rab40c在对树突状细胞功能的影响上有重要意义,并且为阐述Wnt通路调节树突状细胞分化过程的机制奠定了基础。研究方法1.构建相关表达载体质粒用RCR的方法扩增出特异性Rab40b和Rab40c的DNA片段,再使用分子克隆技术将其导入FuGW-eXact-6×His-EYFP载体质粒中,获得Fu GW-e Xact-6×His-EYFP-Rab40b和FuGW-e Xact-6×His-EYFP-Rab40c载体质粒,对重组质粒进行测序检验。PCR特异性扩增Tag RFP的DNA片段,经过酶切连接等过程获得FUGW-e Xact-6×His-tag RFP-Rab40b载体质粒。2.建立稳定表达融合蛋白的树突状细胞系将Fu GW-eXact-6×His-EYFP-Rab40b、Fu GW-eXact-6×His-EYFP-Rab40c和FUGW-e Xact-6×His-tag RFP-Rab40b质粒分别通过磷酸钙沉淀法转染293FT细胞获得慢病毒。病毒感染树突状细胞系DC2.4,经流式细胞仪分选分别获得稳定表达eXact-6×His-EYFP-Rab40b、e Xact-6×His-EYFP-Rab40c和eXact-6×His-tagRFP-Rab40b融合蛋白的树突状细胞系。3.使用新型串联亲和纯化质谱检测树突状细胞中Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白并进行生物信息学分析构建新型纯化标签eXact-6×His,经过两次亲和纯化获得Rab40b和Rab40c的相互作用蛋白复合物。使用液相色谱-电喷雾-串联质谱(High Performance Liquid Chromatography-electrosprary ionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS)连用技术鉴定相互作用蛋白,经过一个在CompPASS(Comparative Proteomics Analysis Software Suite)算法上改进的软件分析系统进行一系列分析得到高可信相互作用蛋白(high-confidence interacting proteins,HCIP)。通过DVAID在线GO分析系统对相互作用蛋白生物学过程(biological process,BP)进行GO(gene ontology)分析,以便分析其功能。4.验证Rab40b和Rab40c蛋白复合物相互作用通过对蛋白的生物信息学分析结果及相关文献的报道,选取一些蛋白进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验验证其相互作用。其中对Rab40b和Rab40c的相互作用,通过激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy,LSCM)观察二者的共定位,说明二者的相互作用。结论1.成功建立稳定表达eXact-6×His-EYFP-Rab40b、e Xact-6×His-EYFP-Rab40c和e Xact-6×His-tag RFP-Rab40b融合蛋白的DC2.4细胞系。2.利用建立的新型串联亲和纯化质谱平台分别鉴定了Rab40b和Rab40c的高可信相互作用蛋白26个和16个。3.ElonginB、ElonginC、Cullin5和Rab40b、Rab40c具有相互作用,可能共同参与泛素化过程,为更加深入的阐述Rab40b和Rab40c在生命活动中的功能提供了基础。