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钙是动物体内重要的常量矿物元素之一,是维持机体生理机能的必需物质。甲状旁腺相关肽(Parathyroid hormone related protein , PTHrP)来源于高钙血症相关的恶性肿瘤。在动物泌乳期,PTHrP能够调节骨钙、血钙和乳钙之间的动态平衡。因此,可以通过PTHrP基因来研究泌乳期乳钙变化的分子机理。本研究以奶山羊作为试验动物,提取山羊乳腺组织总RNA,通过反转录的方法获得cDNA并从中克隆出PTHrP基因全CDs区,然后与原核表达载体pET-32a连接构建原核表达质粒;将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态IPTG诱导表达,筛选出最优表达条件后大量表达并将所获融合蛋白纯化;将纯化蛋白与弗氏佐剂乳化后皮下多点免疫大耳白兔,35天后收集血清检测抗体效价和特异性;最后使用所制备抗体进行山羊组织图谱分析,为研究PTHrP基因在泌乳期乳钙沉积中所起的作用奠定基础。(1)山羊PTHrP基因的克隆根据GenBank中牛的PTHrP基因cDNA序列设计引物,使用RT-PCR技术从山羊乳腺组织中克隆出目的基因。经测序和生物信息学分析显示,所克隆片段包含山羊PTHrP基因全CDs区,长534 bp。该序列所编码蛋白质全长177个氨基酸,所编码蛋白含有PTH结构,相对分子质量20.3 kD,等电点10.00,摩尔消光系数22 460,分子式C895H1453N271O265S2,推测出有18个可能的蛋白激酶磷酸化位点,定位于细胞核,N端为信号肽锚点。(2)山羊PTHrP基因的原核表达将PTHrP基因片段插入pET-32a成功构建山羊PTHrP基因原核表达载体,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达。通过筛选获得的最优表达条件为:37℃,IPTG终浓度2 mmol/L,诱导时间6 h。在最佳表达条件下大量诱导后,通过切胶方法成功纯化融合蛋白,为下一步多克隆抗体制备提供条件。(3)多克隆抗体的制备和组织表达图谱分析通过在大耳白兔皮下多点免疫纯化后的融合蛋白,成功制备山羊PTHrP基因兔抗羊多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价达到1: 51 200,经Western blot检测有良好特异性。使用该抗体进行的组织表达图谱分析发现PTHrP广泛存在于山羊各组织中。