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G 蛋白偶联受体 40(G protein coupled receptor 40,GPR40),又称为游离脂肪酸受体1(Free fatty acid receptorl,FFAR1),属于视紫红质家族,可被不同的中、长链游离脂肪酸激活,介导胞外信号向胞内的传递,发挥不同的生物学功能。作为Ⅱ型糖尿病的靶点可以参与胰岛素分泌,也可以参与神经组织发育和肿瘤发展等多种生理病理过程,GPR40功能的深入研究对抗肿瘤药物的开发具有重要意义。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种人体必需的ω-3不饱和脂肪酸。DHA摄入后,以被动扩散的方式进入细胞,并以甘油磷脂的形式成为生物膜的组分;或者被生物酶水解为多种代谢产物,能够参与神经保护、炎症反应、血压调节以及组织再生等多项重要的生理活动。对于肺癌细胞,DHA可以诱导细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞以及抑制细胞侵袭等,在临床上使用可以明显改善肿瘤病人的预后,提高生存率;此外DHA能与其他化疗药协同抗作用,提高疗效,然而对DHA的抗肿瘤分子机制研究不够深入,也没有文献报道多少剂量的DHA在体内能够起到抗肿瘤作用或者起到协同抗肿瘤作用。本课题研究GPR40受体是否介导DHA的抗肿瘤作用,是否介导DHA与紫杉醇的联合抗肿瘤作用。本课题首先通过构建pHBLV-CMV-GPR40载体质粒,通过三质粒表达系统包装慢病毒并感染细胞,获得GPR40高表达的人肺癌H460细胞株,命名为H460-GPR40H;经由公司构建载体 LV-U6-Stuffer-Scaffold-EFS-hCas9-T2A-Puro,包装慢病毒并感染细胞,获得GPR40基因敲低的H460细胞株,命名为H460-GPR40L。通过GPR40高表达或者基因敲低细胞株以及使用GPR40受体抑制剂GW1100研究GPR40受体对DHA单独或者联合紫杉醇的抑瘤作用的影响。本课题通过SRB实验、划痕实验以及Transwell实验结果证实,DHA可以抑制肺癌细胞H460和A549细胞的增殖、迁移和侵袭。120μmol/1的DHA对H460细胞增殖的抑制率为56.5%,而与GPR40受体抑制剂GW1100联合使用时的抑制率为37.6%;120μmol/l的DHA对GPR40高表达H460细胞增殖的抑制率为66.5%,对GPR40基因敲低H460细胞的抑制率为36.8%;结果表明DHA通过GPR40抑制细胞增殖。划痕实验中150 μmol/l DHA单独处理时H460细胞的迁移率为9.1%,而与抑制剂GW1100联合使用时的迁移率为22.3%;150 μmol/l的DHA处理后,GPR40高表达H460细胞的迁移率为4.6%,GPR40基因敲低H460细胞的迁移率为22.7%;表明DHA通过GPR40受体发挥抑制细胞迁移的作用。在Transwell实验中,120μmol/1的DHA处理后,GPR40高表达H460细胞的平均侵袭细胞数为34.0±2.6个,GPR40基因敲低H460细胞的平均侵袭细胞数为71.3±6.8个,表明DHA通过GPR40受体发挥抑制细胞侵袭的作用。实验发现,DHA联合GW1100诱导H460细胞的凋亡率为35.7%显著低于同浓度的DHA单独给药的凋亡率(47.1%),表明DHA通过GPR40受体诱导H460细胞凋亡。周期实验中,300 μmol/1的DHA处理后,H460细胞G0/G1期比例由57.6%上升至86.3%,表明DHA能够诱导H460细胞的G0/G1期停滞。通过Western blot方法检测DHA作用以及DHA与GW1100联合作用后,PI3K/Akt及MAPKs信号通路中关键激酶PI3K、Akt、ERK、JNK和p38的磷酸化水平。结果表明,DHA可以显著抑制细胞的PI3K/Akt信号通路,而对MAPKs无显著影响,并且DHA对PI3K/Akt信号通路的抑制是通过膜受体GPR40介导的。DHA与PTX联合用药发现,PTX(1 ng/ml)时,对H460细胞的增殖抑制率为28.3%,而与DHA(30 μmol/l)联合使用时的抑制率为61.9%;当PTX联合DHA,再加入GW1100时,对H640细胞的抑制率为46.1%;表明DHA可以通过GPR40增强PTX抑制细胞增殖。在迁移实验中,PTX+DHA(30 μmol/l)联合组给药的H460细胞的迁移率(16.2%)显著低于PTX单独给药组(31.7%),并且与PTX+DHA组相比,PTX+DHA+GW1100组的迁移率(26.1%)有明显的升高。而PTX联合DHA对GPR40高表达的细胞的迁移率(7.1%)显著低于GPR40敲低的细胞(24.4%)。表明DHA可通过GPR40增强PTX抑制H460细胞迁移。在侵袭实验中,PTX+DHA(30 μmol/l)的平均侵袭细胞个数为33±6.8个,而PTX+DHA+GW1100组的平均侵袭细胞个数为58±7.5个,而PTX+DHA作用下,GPR40高表达的平均侵袭细胞数为15.9±4.4个,GPR40敲低的细胞的数目为56.7±9.8个,表明DHA可通过GPR40增强PTX抑制H460细胞侵袭。PTX(1 ng/ml)诱导H460细胞的凋亡率为38.7%,而与DHA(60 μmol/1)联合使用时的抑制率为64.8%;当PTX联合DHA,再加入GW1100后,凋亡率降为54.2%;表明DHA可以通过GPR40增强PTX诱导细胞凋亡。总之,本课题的实验数据表明DHA单独或联合紫杉醇的抗肺癌作用是通过GPR40受体起作用的。