论文部分内容阅读
目的探究宿主因子CD63对人轮状病毒(Human Rotavirus,HRV)SA11毒株和人星状病毒(Human astrovirus,HAst V)HAst V-1毒株体外复制的影响,为进一步研究病毒的分子致病机制、病毒与宿主因子的相互作用奠定基础。方法1.采用微量荧光灶法检测HAst V-1和RV-SA11病毒滴度。2.将CD63沉默表达质粒sh RNA-4038、sh RNA-4041和过表达质粒pc DNA3.1-CD63-flag(CD63-Flag)分别转染HAst V-1宿主细胞Caco-2细胞,RV-SA11宿主细胞CV-1细胞和MA104细胞。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测细胞内CD63 m RNA表达量,采用Western blotting检测细胞内CD63蛋白表达,筛选CD63沉默表达和CD63过表达的细胞株。3.以转染后m RNA水平和蛋白水平干扰效率较高的sh RNA-4038质粒组和sh RNA-4041质粒组为CD63干扰组,以m RNA水平和蛋白水平表达量最高的组pc DNA3.1-CD63-flag质粒组为CD63过表达组,CNr为空白对照组,sh NC为转染对照组。用滴度为5.17 log FFU/ml的HAst V-1病毒感染五组细胞,48h后采用微量免疫荧光灶法检测HAst V-1病毒滴度,采用q RT-PCR检测HAst V-1病毒基因拷贝数。4.实验分为CD63干扰组(CD63-L),CD63过表达组(CD63-H),转染对照细胞组(Sh NC)及正常对照细胞组(CNr)。采用体外转染技术将sh RNA-4038、sh NC和过表达质粒CD63-Flag分别转染病毒不同的宿主细胞,转染48小时后感染病毒,采用q RT-PCR检测病毒基因的拷贝数,采用Western blotting检测病毒蛋白的表达。明确CD63表达对HAst V-1和RV-SA11病毒体外复制的影响。结果1.星状病毒宿主细胞Caco-2转染sh RNA-4038和sh RNA-4041质粒后,CD63的表达明显被抑制,与对照组Sh NC相比,sh RNA-4038和sh RNA-4041在m RNA水平的抑制效率分别为91.3%和74.6%;蛋白水平的抑制效率分别为60.2%和50.9%。Caco-2转染pc DNA3.1-CD63-flag质粒后,与对照组Sh NC相比,CD63的m RNA和蛋白表达明显增加(P<0.001)。2.采用滴度为5.17 log FFU/ml的HAst V-1病毒分别感染CD63过表达细胞株和沉默表达细胞株,与正常细胞对照组相比,检测结果为转染sh RNA-4038质粒组HAst V-1病毒滴度下降2.06 log FFU/ml,sh RNA-4041质粒组HAst V-1病毒滴度下降1.88 log FFU/ml,经单因素方差分析,差异有统计学意义(P<0.001)。转染pc DNA3.1-CD63-flag质粒组HAst V-1病毒滴度增加1.19 log FFU/ml,对照组细胞无明显变化,经单因素方差分析,差异有统计学意义(P<0.01)。3.采用滴度为5.17 log FFU/ml的HAst V-1病毒感染细胞后,转染sh RNA-4038质粒组HAst V-1病毒基因拷贝数下降85.4%,转染sh RNA-4041质粒组HAst V-1病毒基因拷贝数下降69.6%;转染pc DNA3.1-CD63-flag质粒组病毒基因拷贝数明显增加,对照组病毒表达量无明显变化(P<0.05)。4.轮状病毒宿主细胞CV-1和MA104转染sh RNA-4038和sh RNA-4041质粒后,CD63的表达明显被抑制,其中CV-1细胞m RNA和蛋白水平抑制效率分别为69.7%和68.5%,MA104细胞m RNA和蛋白水平抑制效率分别为76.4%和69.8%;轮状病毒宿主细胞CV-1和MA104转染pc DNA3.1-CD63-flag质粒后,CD63的m RNA和蛋白表达明显增加(P<0.05)。5.采用滴度为8 log FFU/ml的SA11病毒感染细胞后,CD63-L组病毒基因拷贝数下降41.1%(CV-1)和35.7%(MA104);病毒蛋白表达水平下降51.6%(CV-1)和54.5%(MA104);CD63-H组病毒基因拷贝数和蛋白表达水平明显增加,对照组病毒表达量无明显变化(P<0.05)。结论宿主因子CD63过表达能够促进星状病毒和轮状病毒的体外复制,CD63沉默表达后,病毒复制明显下降。宿主因子CD63的表达与星状病毒和轮状病毒的体外复制呈现正相关。