目的观察重组人内抑素（recombinant human endostatin, rhEndostatin）对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid-derived fibroblasts, KFs）增殖的影响，探讨其作用的细胞与分子机制，为瘢痕疙瘩（keloid）药物治疗及寻找治疗新靶点提供实验依据。方法①瘢痕疙瘩组织的HE染色：术后取瘢痕疙瘩组织，4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、切片；苏木素-伊红（HE）染色；中性树胶封片；显微镜观察并摄片。②KFs体外培养：7例瘢痕疙瘩组织标本（腹部2例，耳垂4例，大腿1例）均来自安徽医科大学附属医院整形外科瘢痕疙瘩患者，按文献方法进行成纤维细胞原代培养，待细胞融合后传代，实验所用细胞均为处于第3代对数生长期的KFs。③细胞鉴定：体外培养的细胞通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色检测对其性质进行鉴定。④细胞增殖检测：取第3代KFs，分别用不同剂量rhEndostatin (6.25×10^-6,1.25×10^-5,2.50×10^-5,5.00×10^-5,1.00×10-4mg/L)作用24h，48h，72h，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测各剂量rhEndostatin对KFs的抑制率，计算rhEndostatin对KFs作用的半数抑制浓度(50%Inhibitionconcentration，IC₅₀)，本实验IC₅₀为5.00×10^-5mg/L。⑤细胞周期检测：传2代培养的KFs接种于6孔培养板中，细胞分设对照组、rhEndostatin组(5.00×10^-5mg/L)、5-氟尿嘧啶（5-FU）组（0.5mg/mL），用无血清的培养液培养24h，使细胞周期同步化，继之换上含20%血清的培养液，并相应加入rhEndostatin (终剂量5.00×10^-5mg/L)和5-FU（终剂量0.5mg/mL），继续培养48h后收集细胞，FCM检测细胞周期。⑥细胞周期相关基因表达检测：应用免疫组化染色技术检测5.00×10^-5mg/LrhEndostatin48h后，KFs对p⁵³、增殖细胞核抗原（preliferation cell nuclear antigen,PCNA）、细胞周期素D1（CyclinD1）和周期蛋白依赖性激酶-4（cyclin-dependentkinase4, CDK₄）的表达情况。结果①HE染色结果：镜下可见瘢痕疙瘩组织真皮内炎性细胞浸润、大量成纤维细胞增殖和胶原沉积；部分胶原纤维排列紊乱，呈束状或结节状，形成纤维条索，发生玻璃样变性。提示该手术标本为瘢痕疙瘩组织。②KFs体外培养结果：组织块接种后7⁸d，其周边可见少许梭形细胞，继之细胞逐渐增多并以组织块为中心呈放射状生长；传2代培养的细胞单层排列，形态均一，呈长梭状，折光性好。③KFs鉴定结果：细胞波形蛋白免疫化学染色显示胞浆均呈棕黄色。④rhEndostatin对KFs增殖的影响：除6.25×10^-6mg/L剂量组外，各剂量组rhEndostatin能明显抑制KFs的增殖，各组间KFs抑制率两两比较差异具有统计学意义（P <0.05），抑制效应与rhEndostatin剂量和作用时间呈一定的依赖关系；其中，5.00×10^-5mg/L和1.00×10^-4mg/L组rhEndostatin作用48h后，细胞生长缓慢，体积变小，数目减少，排列紊乱。⑤r hEndostatin对KFs细胞周期的影响：FCM检测和分析结果显示，对照组KFs细胞周期主要停留在S期（42.21±3.32），G₂/M期细胞较少为（19.70±3.64）；加入rhEndostatin (5.00×10^-5mg/L)后， G₁期细胞由对照组（36.30±4.40）增至（65.09±3.20），而S期和G2/M期细胞显著减少，分别为（12.86±2.14）和（12.78±3.40）。⑥rhEndostatin对p⁵³、PCNA、CyclinD₁和CDK4表达的影响：p⁵³、PCNA、CyclinD₁和CDK₄阳性染色均呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，除CDK4主要位于细胞核和细胞浆，其余均位于细胞核。结果显示，p⁵³、PCNA、CyclinD1和CDK4在KFs中均呈强阳性表达分别为79.32%、89.45%、61.13%和82.34%，经5.00×10^-5mg/L rhEndostatin处理48h后，p⁵³、PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达降低，分别为16.18%、12.23%、24.98%和15.26%。结论rhEndostatin具有抑制KFs增殖的作用，其作用机制可能与rhEndostatin抑制p⁵³、CDK₄、CyclinD₁和PCNA表达有关。