【摘 要】
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第一部分人白细胞弹性蛋白酶抑制因子elafin的克隆及重组腺病毒表达载体的构建、鉴定与表达目的:克隆人白细胞弹性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因cDNA,应用最新的腺病毒载体构
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第一部分人白细胞弹性蛋白酶抑制因子elafin的克隆及重组腺病毒表达载体的构建、鉴定与表达目的:克隆人白细胞弹性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因cDNA,应用最新的腺病毒载体构建系统AdEasy System构建含elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin,为进一步应用其进行气道上皮细胞黏蛋白(MUC)分泌调控的研究打下基础。方法:(1)抽提人肺总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的基因片段,elafin目的片段经纯化双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得腺病毒载体Ad-elafin,继之在293细胞内扩增,利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率,Western-blot检测elafin蛋白的表达。结果:(1)经RT-PCR获得377bp的产物,经酶切、DNA测序,确定所扩增片段为人elafin基因cDNA。(2)质粒经酶切及PCR鉴定证实elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功,Western-blot检测到elafin蛋白的表达。结论:获得编码elafin的基因片段,并成功构建了腺病毒表达载
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