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巴贝斯虫病是由顶复门孢子虫纲梨形虫目的100多种巴贝斯虫引起的,目前已报道能感染人的巴贝斯虫主要有B.microti、B.crassa、B.sp.MOI、B.divergens、B.duncani和B.venatorum六种,其中B.microti最为常见。人的巴贝斯虫病常伴有高寄生虫血症,严重时会导致人死亡,该病无商业化疫苗,亦无可治愈药物,临床上常用阿奇霉素和阿托伐醌联合用药,但失败率高并伴随严重的不良反应。全基因组信息表明巴贝斯虫缺乏传统的三羧酸循环（TCA cycle）,主要依靠无氧糖代谢产生ATP,因此乳酸脱氢酶（LDH）是该类寄生虫能量供应的关键糖酵解酶,有望成为一个药物靶标阻断虫体的能量供应,从而抑制寄生虫的红细胞内增殖。本研究以田鼠巴贝斯虫和东方巴贝斯虫LDH为研究对象,通过解析其蛋白晶体结构,探讨其LDH催化功能域及关键活性位点,并阐明其催化反应的分子机制及关键功能开关位点,主要结果如下:（1）巴贝斯虫LDH生物学功能鉴定。通过体外培养实验证实棉酚和草氨酸盐均在微摩尔范围对B.microti有明显抑制作用,小鼠体内实验进一步证实棉酚在体内也能抑制虫体生长。以B.microti和B.orientalis的c DNA为模板,克隆到全长999 bp的Bm LDH和Bo LDH开发阅读框,并将其分别插入p ET-28a表达载体,重组质粒转化进入大肠杆菌BL21进行重组蛋白表达。纯化后的两个重组蛋白经分子筛层析过滤,其出峰时间约60 min,以四聚体形式存在。重组LDH蛋白免疫原性好,能够区分巴贝斯虫感染的阳性血清和未感染的阴性血清,虫体天然LDH蛋白约为37 k Da,主要定位在虫体胞质中。最后,通过变动的底物或辅因子浓度获得了Bm LDH的米氏常数KM、Kcat、和Vmax等酶动力学参数,并确定棉酚和草氨酸盐对Bm LDH的抑制常数Ki值分别为0.67μM和65.92μM。（2）LDH晶体结构解析。纯化后的r Bm LDH和r Bo LDH经分子筛层析过滤,纯度可达98%,浓缩后用于结晶条件初筛。经结晶条件优化,Bm LDH单晶、Bo LDH单晶及Bm LDH与NADH和草氨酸盐三联共晶晶体均达到X-ray衍射质量标准,通过X-ray衍射收集到三种晶体的结构数据,并应用分子置换法解析其晶体结构。晶体分辨分别为2.79?（Bm LDH单晶）、2.69?（Bo LDH单晶）和1.89?（Bm LDH共结晶）,与人和疟原虫LDH结构比较结构显示Bm LDH和Bo LDH整体结构与人LDH和疟原虫LDH有着高度的保守性。此外,根据晶体结构推测出巴贝斯虫LDH催化反应的分子机制模型。（3）LDH催化活性开关鉴定及验证。以Bm LDH三联共结晶晶体为基础,寻找到十个Bm LDH催化中心与NADH相互作用的氨基酸残基,并对其中七个氨基酸残基进行了点突变研究。体外酶活实验显示G97A、R99A和N138A突变均能显著降低Bm LDH催化活性,其降低程度达86%以上。本研究进一步探索了Bm LDH与人LDH-A催化关键位点的差异,其结果显示突变人LDH-A中这三个氨基酸残基并检测其催化活性证实G97A和N138A突变能够显著降低人LDH-A的催化活性,而R99A突变对人LDH-A的催化活性无影响。Bm LDHR99A突变体共结晶、SPR和ITC实验结果表明R99A突变未造成Bm LDH整体结构的改变,也未影响Bm LDH对NADH的亲和力,但突变影响了Bm LDH催化口袋的正常关闭。（4）分子对接和虚拟筛选。以Bm LDH晶体结构为基础,从15万个小分子化合库中筛选到13种高评分化合物,并对三种棉酚衍生物（NDCA、DBHCA和DHNA）进行活性测试,结果显示化合物DBHCA和DHNA均在微摩尔浓度内抑制Bm LDH催化活性和虫体体外生长,其中化合物DHNA对Vero细胞毒性较低（SI>25）。此外,应用SPR实验进一步测定了这二种化合物结合Bm LDH的药物动力学曲线。综上所述,本研究通过体外培养证实了棉酚和草氨酸盐均在微摩尔范围内抑制B.microti生长,且棉酚还展现出体内抑制活性。分别对B.microti和B.orientalis LDH基因进行了克隆表达及虫体定位分析,并通过酶动力学曲线和酶抑制动力学曲线证实了棉酚和草氨酸盐均以Bm LDH为作用靶点。解析了Bm LDH单晶、Bo LDH单晶及Bm LDH与NADH和草氨酸盐三联共结晶晶体,揭示了Bm LDH催化反应机制及关键酶活催化残基的差异。通过分子对接和虚拟筛选得到一系列潜在的LDH抑制剂,并评估了二种抑制剂对Bm LDH催化活性及虫体体外生长的抑制效果。这些结果将对下一步设计和筛选新型的抗巴贝斯虫的药物奠定基础,同时也为其他顶复原虫的糖代谢途径的研究具有一定的指导作用。