研究背景和目的肝癌是具有高度异质性的复杂物,这为肝癌干细胞的存在提供了理论依据。早期的证据已经说明了肝癌干细胞的扩增有助于肝癌的发生。大量的研究证实肿瘤干细胞具有很强的肿瘤起始的能力、自我更新的能力、较强的转移能力、化疗抵抗以及促进血管生成的能力。与肝癌干细胞相比,肝前体细胞(LPC Hepatic progenitor cell)主要分布在成人的肝脏组织中,具有有限的自我更新能力和较低的分化潜能。肝前体细胞又叫卵圆细胞,主要是分布在肝脏的赫林氏管上的正常上皮细胞。有文献报道OV6或者CK19可以作为LPC特有的标志物,LPC具有向肝实质细胞和胆管细胞双向分化的能力,当发生组织损伤或者炎症时被激活,但只有当发生迁延不愈的炎症刺激时才会产生代偿性的扩增。大量的研究表明LPC的活化扩增可以明显的促进其恶性转变,这可能是由LPC转变成肝癌干细胞的最直接证据。然而在慢性炎症导致肝癌发生的过程中,LPC是否转变成肝癌干细胞的现象及机制并不明确,仍需进一步探究。目前肝癌的常规治疗包括肝癌切除术、肝脏移植、射频消融和经动脉化疗栓塞术等。然而这些常规的治疗方式并不能有效的去除肝癌干细胞,因此肝癌的复发率仍然较高。随着小分子靶点药物的研究不断深入,越来越多的靶点药物开始应用于肿瘤的治疗中去。索拉菲尼作为目前唯一被批准用于晚期肝癌治疗的小分子化合物,已经广泛用于晚期肝癌患者的临床治疗。索拉菲尼在体外激酶抑制实验结果表明,索拉菲尼可以有效的抑制VEGFR1-3、PDGFRβ、C-kit、B-Raf、Raf-1和Flt3等靶点分子。近期有文献报道索拉菲尼可以通过抑制STAT3的磷酸化从而抑制胆管癌的发生。为了去探寻慢性炎症在LPC向肝癌干细胞转化过程中的作用,我们利用大鼠DEN诱癌模型模拟了在肝癌发生过程中随着炎症的加重,LPC的活化扩增更加明显,这一现象到肝硬化阶段更为突出。有趣的是清除大鼠体内的巨噬细胞后抑制了CK19和OV6双阳性这种可能LPC来源的肝癌发生。我们进一步研究发现TNF-α可以通过调节UBD和Chk2的表达,从而引起了染色体的不稳定性,这可能是肝前体细胞发生恶性转变的原因。临床病理指标及预后信息分析证明CK19和OV6双阳性的肝癌患者预后更差,并且对索拉菲尼治疗更为敏感。因此我们的结果不仅阐明了慢性炎症导致LPC向肝癌干细胞恶性转变的分子机制,同时还提出了一种全新的分子分型,为索拉菲尼的临床应用提供了指导。研究方法:1.利用免疫组织荧光共染的方法检测人的肝脏组织(正常肝、纤维化/肝硬化、肝癌癌旁)中LPC标志物CK19和OV6的表达情况,观察在肝癌发生各个阶段中LPC扩增情况。2.给SOX9-Cre ERT2 DTR-e GFP示踪小鼠腹腔注射DEN和CCl4试剂,建立DEN+CCl4肝癌发生模型,对肝癌组织利用H&E和免疫组化染色检测a-SMA和GFP的表达情况,观察该小鼠模型在肝癌阶段中LPC扩增情况。3.给大鼠注射DEN试剂,建立大鼠肝癌发生模型,通过免疫组化的方法对大鼠肝癌发生各个阶段的肝脏组织(正常肝、纤维化/肝硬化、肝癌癌旁)中CK19和OV6的表达情况进行检测,观察在大鼠肝癌发生各个阶段LPC扩增情况。4.对分选出来的OV6阳性的LPC进行RT-PCR检测成熟的肝细胞标志物(Ttr、Alb)和胆系标志物(CD133、CK19、SOX-9、CD90)的m RNA的表达情况,观察OV6阳性的LPC是否为前体源性。5.对原代LPC种植在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤组织分别进行H&E染色、免疫组化检测AFP的表达和免疫荧光共染检测CK19(红色荧光)和OV6(绿色荧光)的表达情况,鉴别荷瘤组织是否为LPC源性的肝癌组织。6.对大鼠肝硬化阶段的组织进行H&E染色分析和免疫组化方法检测CD68、TNF-α、IL-6的表达情况,观察大鼠诱癌肝硬化阶段组织的炎症浸润和炎性因子的表达。7.通过尾静脉注射Gd Cl3的方法建立大鼠巨噬细胞清除模型,利用免疫组化方法检测肝癌组织中CK19和OV6的表达情况,统计CK19和OV6双阳性的肝癌比例。8.对大鼠和小鼠的原代肝细胞以及肝前体细胞系(WB、LEPC)进行IL-6Rα、IL-6Rb和TNFR免疫蛋白印迹检测,观察IL-6Rα、IL-6Rb和TNFR的表达情况。9.将TNF-α长期作用的WB细胞种植于NOD/SCID小鼠皮下,对其成瘤的组织进行H&E染色、免疫组化检测AFP的表达和免疫荧光共染检测CK19(红色荧光)和OV6(绿色荧光)的表达情况,观察荷瘤组织是否为LPC来源的肝癌。10.利用体内有限稀释的方法,观察TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞系在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤能力。11.利用流式细胞检测技术分析TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞系中CD90和Ep CAM的表达情况,观察炎症因子TNF-α长期作用是否促进LPC向肝癌干细胞转变。12.对TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞进行染色体核型分析检测,分析WB-F344和LEPC细胞的染色体数目,研究TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞是否发生了染色体不稳定性。13.利用蛋白免疫印迹、RT-PCR和细胞免疫荧光等技术检测TNF-α长期作用的WB-F344和LEPC细胞中DNA损伤、细胞有丝分裂检查点和中心体的标志物,探究染色体不稳定性的机制。14.利用免疫组化分析技术,分别检测了163例肝癌组织中CK19和OV6的表达情况,统计分析CK19和OV6双阳性组和对照组的临床病理信息和患者预后资料,研究CK19和OV6双阳性患者的病理特征和预后关系。15.利用蛋白免疫印迹的方法检测TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞中加入索拉菲尼后STAT3磷酸化水平,探究索拉菲尼抑制TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞生长的机制。16.利用细胞成球实验和流式细胞检测技术,检测TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞加入索拉菲尼后的成球数目和细胞凋亡比例,探究索拉菲尼对TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞功能的影响。17.利用免疫组化分析技术检测203例肝癌术后服用索拉菲尼和77例术后未服用索拉菲尼的肝癌患者组织中CK19和OV6的表达情况,统计分析各组肝癌患者预后资料,评估索拉菲尼对CK19和OV6双阳性肝癌患者的治疗效果。研究结果:1.在肝癌患者疾病进展过程中,随着病情的进展LPC不断扩增,其中肝硬化阶段LPC明显扩增。2.利用大鼠DEN诱癌模型模拟人的肝癌发生,研究发现大鼠诱癌过程中LPC不断扩增,其中肝硬化阶段LPC明显扩增。3.为了研究肝巨噬细胞对LPC扩增的影响,我们发现DEN大鼠诱癌过程中,在肝硬化阶段巨噬细胞明显浸润,炎症因子分泌增多,说明巨噬细胞可能促进了LPC的扩增。4.我们通过实验发现,在DEN诱癌模型的肝硬化阶段,由慢性炎症刺激扩增的LPC在NOD/SCID的小鼠皮下可以成瘤,说明这个阶段的LPC可能已经向肝癌干细胞发生转化。5.为了进一步验证巨噬细胞在LPC向肝癌干细胞转化过程中的作用,我们建立了Gd Cl3清除肝脏巨噬细胞的大鼠模型,我们发现巨噬细胞清除组,CK19和OV6双阳性的肝癌发生受到抑制。6.我们利用肝巨噬细胞分泌主要炎症因子TNF-α和IL-6分别刺激大鼠肝前体细胞系WB-F344,20w后将其种在NOD/SCID小鼠皮下,发现TNF-α长期刺激的LPC在皮下可以成瘤,这说明了TNF-α可能促进LPC发生转化。7.为了探究TNF-α长期作用的LPC是否具有肝癌干细胞的特征,我们检测了肝癌干细胞标志物CD90和Ep CAM,发现长期刺激组的标志物表达都明显升高,说明TNF-α长期作用的LPC获得了肝癌干细胞特征。8.为了探究LPC向肝癌干细胞转化的具体机制,我们对TNF-α长期作用的WB和LEPC细胞系做了染色体核型分析,发现TNF-α刺激可以导致LPC染色体数目发生改变。9.前期的结果部分说明了CK19和OV6双阳性的肝癌可能是LPC来源的,我们的临床分析发现这部分的肝癌患者预后更差。10.我们发现索拉菲尼可以通过抑制STAT3磷酸化抑制LPC来源的肝癌干细胞生长。11.临床分析研究发现CK19和OV6双阳性的肝癌患者可能对索拉菲尼治疗更敏感。结论:本课题主要是研究肝脏在慢性炎症环境下,LPC可以明显扩增,扩增的LPC在炎症因子的刺激下可以部分转变成为肝癌干细胞。我们通过研究发现,CK19和OV6双阳性的肝癌可以部分认为是LPC恶性转化而来的肿瘤,临床分析结果提示CK19和OV6双阳性的肝癌患者预后更差,并且对索拉菲尼治疗更为敏感。上述的研究结果可能对索拉菲尼在肝癌的临床治疗中有指导价值。