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大蒜是百合科葱属植物生蒜的地下鳞茎,多年的流行病学研究及临床实验发现大蒜具有抗癌防癌、抗动脉粥样硬化、降血压降血脂、抗菌和提高机体免疫力等多种药理作用。研究发现,大蒜的药理作用与它含有的挥发性有机硫化物成分有密不可分的关系。大蒜中的有机硫化物主要是烯丙基硫化物,包括二烯丙基二硫醚(DADS),二烯丙基硫醚(DAS)等,这些硫化物可以抑制多种肿瘤细胞的生长,但其作用机制以及构效关系并不十分清楚。本课题组前期研究发现在多种大蒜制剂中室温条件下检测到的、高含量的高挥发性有机硫化合物包括二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)以及二烯丙基二硫醚(DADS),以AMDS含量为最高。为了进一步探索这三种大蒜有机硫化合物作为新型药物的可行性,本课题首先利用了GC-MS对人工合成的DADS,AMDS及DAS三种有机硫化合物进行了纯度鉴定、杂质分析,对它们在25℃、4℃及-20℃条件下的稳定性进行了评价。本课题的第二部分研究内容是对该三种大蒜有机硫化合物进行了肺癌细胞H460生物学活性的评价；构效关系的研究包括该三种有机硫化合物对人大细胞肺癌H460细胞的抑制、凋亡、细胞周期等生物机制的探索。有机硫化合物的GC-MS纯度检测结果得知DADS、AMDS、DAS的纯度分别为98.8%、96.5%、100.0%。杂质结构鉴定结构表明DADS中的主要杂质为DAS(1.2%)；而AMDS中的主要杂质的结构鉴定为DADS(2.2%)和1-丙烯基甲基二硫醚(MPDS,1.3%)。稳定性研究结果显示三种有机硫化合物DADS,AMDS及DAS在25℃条件下均不稳定,AMDS尤其不稳定,三个月内的纯度已经下降到50%以下；而三种化合物在-20℃C条件下保存三个月后纯度下降都在2%范围内,因此三种化合物在实验过程中应保存在-20条件下。近年来,化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导通路及阻滞细胞周期的机制研究成为现代抗肿瘤药物生物学研究的热点。本课题以人大细胞肺癌H460细胞为研究对象,探索了三种有机硫化合物对肺癌H460细胞的抑制、凋亡、细胞周期等诱导肺癌细胞信号通路、阻滞细胞周期的机制。采用SRB法检测了在50-600μM浓度范围内DADS,AMDS及DAS分别作用于H460细胞24、48、72h后对细胞的抑制作用,600μM的DADS在72h对H460细胞的最高抑制率为74.8%,600μM的AMDS在72h对H460细胞的最高抑制率为65.3%,DAS在600μM范围内对H460细胞没有抑制作用,三者对H460细胞的抑制作用大小顺序为DADS>AMDS>DAS。使用倒置显微镜对DADS,AMDS及DAS在不同作用浓度和作用时间下对H460细胞形态的影响进行了观察,研究发现DADS和AMDS的作用可以使H460细胞形态发生改变,细胞收缩变圆,并且随着培养时间的延长,圆形细胞的数目越来越多,且细胞有变大的现象。DAPI染色测定结果显示400μM的DADS和AMDS处理H460细胞后,细胞出现染色质凝聚,核固缩等现象,并有典型的凋亡小体产生,DAS即使在600μM范围内也并不能引起H460细胞产生凋亡小体,由此可知,DADS和AMDS对H460细胞的抑制作用是通过诱导H460细胞凋亡引起的。FITC-Annexin V/PI双荧光染色法测定结果表明随着DADS和AMDS浓度的增加,H460细胞的凋亡率也随之增加,呈现明显的剂量依赖关系,而在600μM浓度范围内的DAS不能引起细胞凋亡。Ellisa试剂盒测定结果显示300μM和600μM的DADS和AMDS可以显著地提高了caspase3、caspase8、caspase9的表达量,存在剂量依赖关系,600μM的DAS则没有该作用；流式细胞术检测结果显示DADS和AMDS处理组细胞的线粒体膜电位降低,细胞内反应活性氧的水平升高,600μM的DAS则对两者没有作用；Western blotting检测结果发现DADS和AMDS显著地降低了Bcl-2、Bcl-XL蛋白的表达水平,增加了Bax蛋自的表达,对促凋亡分子的细胞色素C(Cytochrome c)的表达量也有所提高,同时提高了死亡受体途径中FADD蛋白的表达水平；RT-PCR检测法进一步证实了DADS和AMDS也可以在mRNA水平上降低Bcl-2的表达水平,增加Bax的表达水平,同时增加了caspase3及FADD的表达水平,由此说明,线粒体途径与死亡受体途径同时参与了H460细胞的凋亡过程。PI染色后流式细胞术检测数据显示DADS和AMDS将H460细胞阻滞于G2/M期,DAS在600μM范围内对H460细胞无周期阻滞作用。Western blotting实验结果显示DADS和AMDS可显著地上调了p53及p21蛋白的表达量,下调了PCNA、Cyclin B1、Cyclin A2蛋白的表达量,呈现剂量依赖关系。同时,DADS和AMDS能提高Cyclin B1的nRNA水平。划痕实验结果显示,DADS和AMDS显著地增加了24h后细胞的划痕的宽度,而600μM范围内的DAS则对划痕宽度无影响,Western blotting检测数据表明DADS和AMDS可以提高E-cadherin黏附蛋白的表达量。综上所述,所评价的大蒜有机硫化合物二烯丙基硫醚(DAS)、甲基烯丙基二硫醚(AMDS)、二烯丙基二硫醚(DADS)批次的纯度已达到或接近作为单一药物的要求,但它们的稳定性有待通过特殊制剂技术来进一步提高。这三种有机硫化合物对肺癌细胞H460的生物活性研究表明,DADS和AMDS能够有效地抑制H460细胞增生,而DAS的抗肿瘤效果非常有限。DADS和AMDS可以将肺癌细胞H460阻滞于G2/M期,这种细胞周期阻滞作用与DADS及AMDS上调p53及p21蛋白的表达量及下调PCNA,cyclinB1及cyclin A2蛋白的表达量有关。DADS及AMDS还可以通过提高E-cadherin的蛋白表达水平降低肺癌细胞H460的迁移能力。这些研究将有助于人们更深入理解这三种大蒜有机硫化合物的抗肺癌的机制,为将来这三种有机硫化合物可能在非小细胞肺癌的临床应用提供了理论依据。