D-阿洛酮糖（D-allulose）是一种只微量存在于无花果、小麦和蜂蜜的稀有糖,具有低热量、甜度高（其甜度是蔗糖的70%,热量为蔗糖的0.3%）的优点,在食品、医药等行业具有广泛的应用潜力。D-阿洛酮糖常用的合成方法是以D-阿洛酮糖3-差相异构酶转化D-果糖获取,目前转化率在28%-33%之间,生产和纯化成本较高。本研究构建了基于荧光的D-阿洛酮糖3-差相异构酶筛选体系,结合酶空间结构分析,对来源于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的At-DPEase基因进行定点饱和突变,筛选获得转化率提高的D-阿洛酮糖3-差相异构酶突变子,具体内容包括:（1）构建包含At-DPEase基因的重组载体pET-20b-At-DPEase,将重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,获得重组工程菌E.coli BL21/pET-20b-At-DPEase,并对重组工程菌进行蛋白纯化及表达并酶学性质进行分析,测定不同温度、pH、金属离子对其酶活的影响,最终确定了其最适反应温度为60℃、最适反应pH 8、最适金属离子Mn2+,在不加入Mn2+时转化率达到了31.59%,在加入Mn2+时转化率达到了32.95%（2）本项目构建了一种包含D-葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、辣根过氧化物酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的荧光显色体系,体系中通过葡萄糖氧化酶、D-葡萄糖异构酶在以D-果糖为底物生成的H2O2可与辣根过氧化物酶产生荧光反应,筛选方法是葡萄糖氧化酶（5000 U/L）、D-葡萄糖异构酶（5000 U/L）、D-阿洛酮糖3-差向异构酶（主要是突变酶）在反应温度60℃、pH 8.0反应2 h,随后将反应溶液稀释1000倍与辣根过氧化物酶（2500 u/L）使用酶标仪在λex/em=315/410 nm条件下测定其荧光强度,而体系中D-果糖的含量则与D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性呈负相关,由此建立了荧光强度与D-阿洛酮糖的含量的关联,为D-阿洛酮糖3-差向异构酶高转化率突变子的筛选奠定了基础。（3）使用Swiss-model软件模拟获得At-DPEase三维结构,并且对结合活性口袋及关键活性位点进行分析,选取了Leu33、Ala36、Gly65、Glu150、Glu244、Cys213、Asp256共7个突变位点进行点饱和突变,结合高通量筛选体系进行筛选,然后进行摇瓶验证,最终发现C213P和C213A反应8 h后转化率分别提高了2.9%和4.41%。其中C213A突变菌比重组酶最适反应温度由60℃提高至65℃。在C213A位点的突变情况的基础上选取了临近的G212、N214位点进行进一步的点饱和突变,结果显N214D突变子反应8h后转化率提高了2.5%。又以而以C213A为突变模板对G212、N214位点进行饱和突变,结果显示转化率均低于AT-DPEase的31.59%并未获得转化率高于At-DPEase的突变子。对At-DPE-C213A、At-DPE-C213P、At-DPE-N214D突变子的发酵培养基的碳源、氮源和无机盐离子浓度以及发酵时间、诱导温度和诱导时间进行优化,发现发酵培养基最佳配方:鱼骨蛋白胨20 g/L、糊精10 g/L、甘油4%（V/V）、无机盐浓度A（m L）:B（μL）:C（μL）=5:50:50在25℃下诱导48 h,E.coli/pET-20b-At-DPE-C213P酶活提高至102.30U/mL,提高幅度最大为53.99%,反应时间缩短了2 h。