背景:肺癌是目前全球最为常见的恶性肿瘤,在中国每年肺癌新发病例达73.33万人,占癌症新发病例总数的17.08%,死亡病例达61.02万人,占癌症死亡病例总数的21.68%。目前肺癌的治疗整体情况仍不理想,各项研究仍有待于开展。Rac家族小GTP酶3（Rac family small GTPase 3,Rac3）蛋白是一种分子量为21k D的小G蛋白,属于Rho家族中Rac家族成员,该家族被认为是细胞骨架的重要调节剂,在肿瘤及神经发育中起到重要作用。Rac3在正常神经元组织中表达较高,此外在多种肿瘤细胞,如胶质瘤、乳腺癌、肺腺癌及前列腺癌中高表达,但是,Rac3在肺癌发生发展中作用机制仍不明确。前期利用Rac3基因编辑的细胞进行RNA测序技术检测发现,Rac3可能调控黑色素瘤抗原A6（Melanoma antigen A6,MAGEA6,也被称作MAGE3B,MAGE6）。MAGEA6是黑色素瘤抗原家族的成员,该家族成员在真核生物中保守,在肿瘤中常被异常激活。MAGEA6通过抑制AMPKα调节m TORC1,调节自噬,促进肿瘤生存。Rac3是否调控MAGEA6,并且是否与肺癌发生发展有关,尚未报道,有待进一步验证。自噬是一种高度保守的生物学进程,在肿瘤中往往起到双刃剑的作用:一方面自噬可以增加肿瘤抵抗恶劣环境的能力,另外一方面自噬也可以直接导致肿瘤细胞死亡。鉴于MAGEA6对自噬相关的AMPK/mTOR通路有调控作用,暗示Rac3可能会调控自噬。但是,Rac3在非小细胞肺癌中影响自噬、凋亡的机制如何,目前国内外相关的研究较少,需要更全面和更具体的探索。研究方法:1.通过TCGA数据挖掘的方式,比较癌与正常组织中Rac3的表达,分析不同临床特征与肿瘤中Rac3表达的相关性,通过绘制Kaplan-Meier曲线及COX回归分析研究Rac3表达与总体生存之间的关系。2.在线设计sg RNA序列,构建CRISPR/cas9基因敲除质粒,敲除A549细胞中Rac3基因并构建稳定敲除细胞株。通过Rac3过表达慢病毒感染A549细胞构建稳定过表达细胞株。3.对Rac3敲除及过表达的细胞株进行RNA测序并寻找差异基因,通过差异基因韦恩图分析得到Rac3敲除及过表达后直接影响的基因,并通过实时荧光定量PCR法对这些基因进行低通量验证。4.采用EBSS饥饿法诱导自噬,利用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、SQSTM-1/p62,以及利用LC3双荧光慢病毒感染方法检测自噬水平。5.诱导自噬后,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡比例,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位,Western Blot检测caspase3活化,共同验证细胞凋亡的发生。6.通过Western Blot法检测差异基因MAGEA6及AMPKα的变化,并检测与自噬相关的ERK1/2通路、AKT通路和m TOR通路蛋白的变化。7.对Rac3敲除的细胞株转染MAGEA6过表达质粒逆转MAGEA6表达,Western Blot法检测LC3、活化的caspase3、AMPKα和磷酸化AMPKα,考察过表达MAGEA6能否逆转Rac3敲除引起的自噬、凋亡及通路变化。8.制备组织芯片,通过免疫组化染色,在组织水平检测Rac3、MAGEA6和另一个Rac3调控的、在A549细胞中低丰度的基因GABRA3的表达,并进一步分析该三个基因表达与临床特征及肿瘤预后间的关系。9.组织芯片通过免疫组化方式检测AMPKα和活化的caspase3,通过与Rac3、MAGEA6、GABRA3进行相关性分析,在组织水平验证Rac3通过MAGEA6影响AMPKα通路,以及GABRA3是否与AMPKα通路及活化的caspase3存在相关性。结果:1.对1145例TCGA病例进行数据挖掘,Rac3在肺癌中表达高于癌旁组织,在肺鳞癌中的表达较腺癌组织高,差异具备统计学意义。2.Rac3表达与年龄、性别、吸烟史、肿瘤在肺叶分布及T2分期之间的相关性具备统计学意义,p<0.05;与中央型肺癌、R0切除及肿瘤分期之间的相关性不具备统计学意义。3.Kaplan-Meier曲线提示非小细胞肺癌中Rac3高表达预后不良,p<0.05,具备统计学意义;在进一步的病理亚型分析中发现在鳞状细胞癌中Rac3高表达提示预后不良,p<0.05,有显著性,但是在腺癌中Rac3对生存的影响不显著,p>0.05。4.单因素的COX分析提示提示T、N、M分期及临床病理分期、肿瘤所在肺叶、肿瘤是否完全切除和Rac3的高、低表达这些因素都是影响肿瘤预后的危险因素。多因素的COX分析提示Rac3的高、低表达是影响预后的独立危险因素。5.GSEA富集分析得到Rac3上调通路25个,其中前5的包括RNA聚合、DNA复制、剪接体、细胞周期、基础转录因子等信号通路,下调通路1个,为醛固酮调节钠的重吸收通路。6.在线设计2条sg RNA,通过CRISPR/cas9技术成功构建了Rac3敲除的细胞株KO1和KO2,丢失碱基个数分别为2个和35个,Western Blot检测两细胞株Rac3均不表达。7.以log2fold Change≤-2及log2fold Change≥2作为阈值筛选,RNA-Seq结果提示敲除组与对照组相比差异表达基因88个,其中表达上调基因10个,表达下调基因78个。另外,过表达组与对照组相比差异基因160个,其中表达上调基因61个,表达下调基因99个。维恩图提示差异基因中有4个存在交集,分别为:ADAMTS2、CSRNP3、GABRA3和MAGEA6。实时荧光定量PCR进行低通量验证,证实4个基因均在Rac3被敲除时下调,而Rac3过表达时上调,差异具备统计学意义。8.与野生型A549细胞相比,在EBSS诱导自噬时,Rac3敲除的细胞株LC3-II/LC3-I比值上升、SQSTM-1/p62的水平下降,Rac3过表达细胞株的LC3-II/LC3-I比值下降,差异具备统计学意义。LC3双荧光慢病毒感染后诱导自噬,与野生型相比Rac3敲除后荧光聚集点的数量明显增多,而Rac3过表达组荧光聚集点数量降低。提示Rac3过表达抑制自噬,Rac3被敲除时促进自噬。9.Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测提示,经诱导自噬后凋亡比例上升,对比野生型A549细胞,Rac3敲除细胞中凋亡比例更高,而Rac3过表达细胞中凋亡比例较低。JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位反映凋亡情况,诱导自噬后凋亡显著上升,对比野生型A549细胞,Rac3敲除细胞中JC-1绿色荧光更强,而Rac3过表达细胞中则JC-1绿色荧光较弱。诱导自噬后Western Blot法检测活化的caspase3水平,与野生型A549细胞相比,Rac3敲除细胞中活化的caspase3表达更高,Rac3过表达细胞中活化的caspase3表达较低。提示Rac3敲除促进自噬诱导的凋亡,Rac3过表达抑制自噬诱导的凋亡。10.Western Blot法检测MAGEA6和自噬相关的通路蛋白发现,与野生型细胞相比Rac3敲除细胞中MAGEA6较低,AMPKα和磷酸化AMPKα水平较高,磷酸化m TOR水平较低;而Rac3过表达细胞中MAGEA6较高,AMPKα和磷酸化AMPKα表达较低,磷酸化m TOR水平较高。提示Rac3通过上调MAGEA6的表达降低AMPKα及磷酸化水平,激活m TOR通路,进而可能抑制自噬及凋亡。11.对Rac3敲除细胞株转染MAGEA6过表达质粒,Western Blot检测提示在过表达MAGEA6后,因敲除Rac3引起的LC3-II升高、caspase3的活化和AMPKα磷酸化的升高都得到逆转。12.制备芯片,经过免疫组化染色检测Rac3、MAGEA6和GABRA3在非小细胞肺癌中的表达并分析临床特征。Rac3和MAGEA6均在肿瘤中高表达,Rac3在鳞癌、大于3厘米的肿瘤、临床分期为Ⅱ-Ⅲ期、Ki67阳性的患者中表达增高,p<0.05。MAGEA6在Ⅱ-Ⅲ期患者中高表达,p<0.05。GABRA3表达在各组间均无差异。13.构建的组织芯片通过免疫组化染色检测AMPKα和活化的caspase3表达,并与Rac3、MAGEA6、AMPKα等进行相关性分析,提示在组织水平上Rac3表达与MAGEA6呈显著相关,MAGEA6表达与AMPKα呈显著相关,从组织学水平证明Rac3通过MAGEA6调控AMPKα通路。GABRA3与AMPKα及活化的caspase3不存在相关性。结论:1.Rac3在非小细胞肺癌中高表达,在正常肺组织低表达,且Rac3高表达是非小细胞肺癌预后不良的独立的生存危险因素。2.转录组学分析结果显示,在Rac3敲除后存在88个差异表达基因,其中上调10个,下调78个;Rac3过表达后存在160个差异表达基因,其中上调61个,下调99个。其中Rac3敲除及过表达都存在的差异基因有4个,分别是ADAMTS2、CSRNP3、GABRA3和MAGEA6。3.Rac3在非小细胞肺癌A549细胞系中抑制自噬,并抑制自噬诱导的凋亡。4.Rac3抑制自噬是通过上调MAGEA6实现的,上调MAGEA6导致AMPKα磷酸化降低,m TOR通路激活,进而抑制自噬及其引起的凋亡。5.组织水平上Rac3、MAGEA6都在癌组织中高表达,且以上两个基因高表达都为不良预后的危险因素。6.组织水平上Rac3与MAGEA6、GABRA3之间存在相关性,MAGEA6与AMPKα之间存在相关性,提示Rac3可能通过MAGEA6调控AMPKα通路,进而影响自噬和凋亡。