背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,简称为“冠心病”。近年来,药物治疗、介入治疗和外科手术极大的改善了冠心病病人的预后,但是仍有许多冠心病病人的预后不佳。此外,心血管疾病的患者对治疗的反应差异比较大,存在较大的个体差异性。因此深入了解这种疾病的分子机制,对于更加精准的诊断和治疗冠心病是非常重要的。冠状动脉血管管壁是由多种细胞组成的,其中内皮细胞和平滑肌细胞是动脉血管管壁中最重要的细胞成分,这些细胞的自身状态以及相互之间的作用对于维持血管壁的正常生理功能是非常重要的。研究显示,内皮细胞、平滑肌细胞之间存在着复杂的信号传递过程,它们之间的信号传递过程对于保持内皮细胞和平滑肌细胞的生理功能有着重要的作用。血管壁的各种细胞之间如何进行细胞间的信号通讯以及这种相互关系是如何被周围环境所影响的需要进一步的研究来证实。通过对体内及体外培养的多种细胞进行研究表明,细胞间的通讯与外泌体（exosomes）之间存在着重要的联系。外泌体可以将其携带的核酸、蛋白质、细胞因子等内容物转运到靶细胞内,进而参与调控受体细胞的各种生理行为（包括细胞增殖、死亡、迁移及表型转化等）。通过本课题组的前期研究表明,包含内皮细胞与平滑肌细胞的共培养系统能够明显抑制平滑肌细胞炎症因子IL-1β和IL-18的表达,所以我们想要进一步研究并证实外泌体在内皮细胞与平滑肌细胞共培养中的可能作用及隐藏在这个作用后面的相关机制。microRNA（miRNA）已经被证明具有非常广泛多样的生物学功能。大量基础研究表明,miR-181b可通过下调多种靶基因的方式参与到心血管系统的调控工作中。在冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜疾病、心力衰竭、心肌病等各种心血管疾病的调控中发挥重要作用。大量研究表明miRNA可在不同细胞中通过调控不同的靶点影响细胞焦亡。miR-181b是一种机械敏感性miRNA,它的表达水平在主动脉瓣膜内皮细胞中受到血管剪切力的影响。但是其在内皮细胞源性外泌体中的表达水平以及与平滑肌细胞焦亡的关系尚不明确。方法:1.分别建立平滑肌细胞单独培养和内皮细胞、平滑肌细胞共培养系统,在低剪切力条件下观察单独培养和共培养对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。Western blot方法检测Caspase-1、GSDMD-N、NLRP3的蛋白表达水平,qRT-PCR方法检测miR-181b、Caspase-1、GSDMD-N、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达水平,ELISA方法检测IL-1β和IL-18的表达情况。2.用无外泌体的血清培养内皮细胞,分别收集低剪切力和静息状态处理的细胞上清液。采用超速差异离心方法收集外泌体。外泌体的表征采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪技术（NTA）以及蛋白电泳技术。采用microarray技术检测不同处理条件下外泌体中miRNA的表达情况。选取目标miRNA进行qRT-PCR方法验证。3.观察低剪切力处理下,内皮细胞源性外泌体对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。Western blot检测Caspase-1、NLRP3的蛋白表达水平,qRT-PCR方法检测miR-181b、Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达水平,ELISA方法检测IL-1β和IL-18的表达情况。4.以miR-181b为检索关键词,通过常用miRNA靶基因预测网站Target Scan、Pic Tar和miRanda预测miR-181b的靶基因,根据各个网站的预测评分并参考既往文献得到预测的靶基因STAT3,靶基因验证采用双荧光素酶实验。5.使用miR-181b mimics上调平滑肌细胞中miR-181b的表达水平,观察miR-181b对STAT3的影响。同时检测Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18等焦亡指标的水平。通过共转染miR-181b inhibitor和siSTAT3来同时改变miR-181b和STAT3的表达,以便进一步确定miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞细胞焦亡的水平。6.数据分析:所有数据的表达形式采用均数±标准差形式,所有实验数据至少重复3次。两组间的比较用t检验,多个组间的比较采用ANOVA分析。数据录入和图形绘制使用Graph Pad Prism 7.0软件,p值小于0.05说明差异存在统计学显著性。芯片数据及生物信息学分析采用R 3.4软件。结果:1.利用Western blot方法检测平滑肌细胞中细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD-N的表达。结果显示:低剪切力可以显著促进血管平滑肌细胞中Caspase-1、GSDMD-N的表达（p<0.01）,RT-PCR也提示细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的mRNA表达情况明显高于对照组。ELISA检测提示炎症因子IL-1β和IL-18的表达同样高于对照组,差异具有统计学意义。进一步分析表明共培养系统中内皮细胞可以抑制平滑肌细胞的细胞焦亡水平。在细胞共培养系统中,平滑肌细胞的细胞焦亡相关蛋白GSDMD-N、NLRP3的表达水平显著低于平滑肌细胞单独培养系统。同时RT-PCR检测也提示GSDMD-N、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平也是显著低于平滑肌细胞单独培养系统的。ELISA检测提示IL-1β和IL-18的表达具有同样的趋势,差异具有统计学意义。2.对于内皮细胞单独培养系统收集上清液后采用超速差异离心方法分离外泌体并进行外泌体的表征研究。通过TEM结果提示提取的外泌体形状为茶杯状结构,符合外泌体的特征。NTA检测结果提示外泌体的直径范围在60-130nm之间,平均值为110nm,符合外泌体的特征。蛋白电泳结果表明外泌体表面蛋白CD63、CD9阳性表达,同时Calnexin表达阴性。根据以上结果提示成功提取出了外泌体。3.外泌体芯片数据结果提示共有16种miRNA差异表达（Fold change大于2同时p<0.05）,其中12种miRNA上调,4种miRNA下调。GO分析提示差异表达的miRNA的生理功能主要包括细胞间通讯、调控核酸代谢、信号转导等。根据表达量分析和前期文献检索的结果选择表达差异最大的miR-181b进行后续分析。RT-PCR结果分析提示低剪切力明显降低内皮细胞源性外泌体中miR-181b的表达。4.通过将外泌体作用于体外低剪切力单独处理的血管平滑肌细胞,RT-PCR方法检测miR-181b的表达,并将实验组和对照组结果进行比较,结果提示miR-181b在低剪切力作用下显著下调,给与内皮细胞源性外泌体处理后平滑肌细胞中的miR-181b的表达高于阴性对照组。通过共培养系统中施加外泌体抑制剂干预处理,研究发现,外泌体可抑制平滑肌细胞中GSDMD-N、NLRP3的表达。在共培养组中加入GW4869后,共培养系统对平滑肌细胞细胞焦亡的保护作用显著被抑制,表明内皮细胞源性外泌体参与了低剪切力条件下对平滑肌细胞焦亡的抑制作用。进一步研究证实转染miR-181b inhibitors可以抑制外泌体对平滑肌细胞的抗细胞焦亡作用,提示外泌体中的miR-181b参与了内皮细胞对平滑肌细胞焦亡抑制的过程。5.根据相关预测网站的结果推测STAT3为miR-181b的靶基因。首先构建含有STAT3mRNA 3’UTR中与miR-181b 5’端种子区域相结合的野生型与突变型的质粒并转染至平滑肌细胞,然后用双荧光素酶实验证实miR-181b与STAT3的靶向关系。结果显示miR-181b可显著抑制野生型STAT3质粒的荧光强度,但是对突变型的质粒荧光强度无影响。然后又检测了STAT3的mRNA表达情况,我们发现过表达miR-181b能够抑制STAT3的mRNA表达水平,这种效应在静息状态和低剪切力处理下都存在。这些结果提示STAT3是miR-181b的靶基因。6.STAT3可促进血管平滑肌细胞细胞焦亡的发生。首先通过转染siSTAT3到平滑肌细胞观察STAT3对平滑肌细胞细胞焦亡的影响。结果表明转染siSTAT3可以降低平滑肌细胞细胞焦亡的发生。Western Blot检测转染后平滑肌细胞中细胞焦亡相关蛋白Caspase-1和NLRP3的表达,结果表明通过转染siSTAT3可使平滑肌细胞中的Caspase-1和NLRP3的表达水平明显下调。同时RT-PCR检测也提示Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18在mRNA水平也是显著低于对照组。ELISA检测提示IL-1β和IL-18的表达具有同样的趋势,差异具有统计学意义。继续通过共转染miR-181b抑制物和siSTAT3确定miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞的细胞焦亡。结果提示下调STAT3的表达可以逆转miR-181b inhibitor对平滑肌细胞的细胞焦亡的促进作用。以上结果说明miR-181b通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞的细胞焦亡。结论低血管剪切力能够促进血管平滑肌细胞焦亡的发生,共培养系统提示内皮细胞能够抑制平滑肌细胞焦亡的发生。内皮细胞可分泌外泌体,这些外泌体的直径在110nm左右,根据芯片数据分析结果提示低血管剪切力可以抑制内皮细胞来源外泌体中miR-181b的表达水平。生信分析提示外泌体中差异miRNA的生理功能集中在细胞间通讯、调控核酸代谢、信号转导等方面。内皮细胞来源的外泌体可通过增加平滑肌细胞中的miR-181b来抑制血管平滑肌细胞细胞焦亡的发生。进一步的分析表明STAT3是miR-181b的候选靶基因并经过双荧光素酶实验得到验证。通过改变miR-181b和STAT3的表达水平,进一步证实了低血管剪切力通过外泌体miR-181b/STAT3轴来调控平滑肌细胞焦亡的发生。