目的:肺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，在中国，其死亡率和发病率都很高，而生存率却很低，其中女性5年生存率仅为16.1％。研究表明，血液中存在的一些蛋白质等生物大分子可以为肺癌的早诊、早治、耐药反应、预后等结局事件提供关键信息，从而提高癌症的早诊率和促进临床医生给患者制定更有效的治疗措施。这些生物大分子一般称为生物标志物。近年来研究表明，人类血液中的一些小RNA也起到生物标志物的作用。mi croRNA是一类非编码的RNA序列，具有内源性、片段小等特点。它们主要通过与靶mRNA互补结合，使靶mRNA降解或使靶mRNA翻译终止，从而达到影响基因正常表达，使细胞、机体出现不同的临床表现，从而发挥功能。研究表明，对于大多数已发现的miRNA，单个miRNA往往可以与几十个靶mRNA相结合，而很多mRNA往往又能与多个miRNA结合，受多个miRNA的干扰。因此，miRNA的作用网络是十分巨大的。随着研究的深入，人们发现miRNA的生物学作用受自身基因多态性的调节。当一个基因多态位点位于pri-miRNA或pre-miRNA上时，可通过影响Drosha或Dicer酶的作用从而影响成熟miRNA的表达量。当一个基因多态位点位于miRNA的5种子区域时，可通过影响miRNA与靶mRNA的结合能力影响miRNA的功能发挥。研究表明，miRNA的差异表达谱可在很多肿瘤组织中观察到，且miRNA的高表达或低表达常伴有增高的肿瘤危险度或较差的预后。位于miRNA关键位点的基因多态性也可提示肿瘤的危险度和预后的好坏。关于miRNA基因多态性与肺癌预后的关系研究得还不够深入、透彻。因此，本研究拟通过研究miRNA单核苷酸多态性与非小细胞肺癌患者预后的关系来研究miRNA在肿瘤中的作用，并通过构建体外细胞模型来研究miRNA单核苷酸多态性在肺癌细胞中发挥作用的机制，以期对miRNA在肺癌的作用机制有一个更加完善的了解，并为肺癌的治疗提供更加精确的方案，提高治疗效果，延长患者寿命和生命质量。　　研究方法:本文综合meta分析结果和生物信息学分析结果，筛选拟研究的miRNA的基因多态位点，构建队列研究多态位点与非小细胞肺癌NSCLC预后的关系，并通过功能学实验验证多态位点的功能以及可能的靶基因。　　1、meta分析的材料和方法　　使用SCIE、PubMed、CBM、CNKI、万方、Google学术搜索、引文索引、参考文献列表索引等在线数据库或资源，进行按关键词或主题词进行同义词、近义词扩展检索，根据各种排列组合综合检索得到所有可能的文献。通过标题、摘要等的阅读纳入可能相关的文献，排除重复发表的文献，提取数据，使用STATA13.0软件进行meta分析计算合并后的HR和95％CI，确定是否存在异质性，并进行相应的发表偏倚分析和敏感性分析，以确定研究的质量。　　2、队列研究的材料和方法　　通过dbSNP、miRBase、Patrocles、HapMap、viennaRNA等数据库和软件筛选拟研究的单核苷酸多态性(SNP)位点，建立队列进行验证。队列研究得到中国医科大学伦理委员会的审批通过，并与每一位患者签定了知情同意书。调查前，制定纳入、排除标准，进行队列的构建，纳入的所有研究对象经过病理类型的确认，所有调查人员进行流行病学调查培训，收集患者的年龄等基线资料和病理类型等临床信息，同时采集患者静脉血，提取DNA，进行基因分型。并对每一个患者进行电话随访，每三个月进行电话随访一次，直到患者死亡、失访或队列随访结束。通过沈阳市CDC、沈阳市公安局、患者病志确定患者死因和死亡日期。收集60例患者的肺癌组织，提取总RNA，使用2-△△CT法计算不同基因型患者成熟体miRNA的相对表达量，计算不同基因型患者的中位生存时间(MST)，使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线图，并用log-rank法检验生存时间的差异是否有统计学意义。采用单因素和多因素的COX比例风险回归模型计算粗HR及其95％CI和调整后的HR及其95％CI，计算基因多态性与预后的关联强度。　　3、功能学研究的材料和方法　　构建含miR-149野生等位基因的过表达载体、含miR-149 rs2292832突变等位基因的过表达载体，慢病毒包装质粒，稳转入人非小细胞肺癌A549细胞系，得到稳定表达细胞株，使用CCK-8法检测细胞的增殖能力，使用细胞周期检测试剂盒检测细胞周期的变化，使用CCK-8法检测经DDP处理的细胞增殖能力，从而判断细胞的药物敏感性。使用Starbase v2.0数据库筛选得到miR-149的靶位点TOP1，使用String软件进行DNA拓扑异构酶1(TOP1)基因的GO分析和KEGG分析，构建含TOP13 UTR区的双荧光素酶报告系统判断miR-149与TOP1的靶向作用，使用qRT-PCR法检测miR-149和TOP1基因的mRNA表达水平，使用western blot进行TOP1蛋白表达量的检测。　　结果:　　1、meta分析结果　　(1) miR-146a rs2910164与肿瘤预后的关系　　本研究发现GG基因型与肿瘤总生存率(OS)的关系主要存在于美国人群里。我们未观察到miR-146a的单核苷酸多态性SNP与全肿瘤的无病生存率DFS、无复发生存率RFS的关系。未发现miR-146a基因多态性与非小细胞肺癌和消化系统肿瘤预后的关系。　　(2) miR-196a2 rs11614913与肿瘤预后的关系　　本研究发现含C基因型与肿瘤预后有关，且提示预后较差，经分层分析结果显示，这种关系存在于亚洲人群、消化系统、非小细胞肺癌中。而且携带有C的基因型与全肿瘤的RFS有关。未观察到与DFS的关系。　　(3) miR-149 rs2292832与肿瘤预后的关系　　本研究发现C等位基因与全肿瘤OS有关，且提示预后良好，随着C等位基因数量的增多效应增强。经分层分析发现，C等位基因与非小细胞肺癌OS有关，却与消化系统OS无关。　　(4) miR-499 rs3746444与肿瘤预后的关系　　本研究在显性模型中观察到miR-499基因多态性与肿瘤预后的关系，但未在亚洲人群、消化系统肿瘤和非小细胞肺癌中观察到miR-499基因多态性与肿瘤预后的关系。　　(5)发表偏倚检验和敏感性分析　　经漏斗图和Begg检验，未观察到研究存在发表偏倚。经敏感性分析，发现研究结果稳定可靠。　　2、队列研究结果　　(1)5个SNP位点与OS的关系　　miR-149 rs2292832的含C基因型与预后有关，且提示预后较好，含有C基因型的患者MST更长，死亡率较低。未观察到miR-146a rs2910164、miR-196a2rs11614913、miR-423 rs6505162、miR-608 rs4919510与NSCLC预后的关系。　　(2)5个SNP位点与OS关系的分层分析　　分层分析结果显示，在多个亚组中miR-149基因多态性与OS的关系具有统计学意义。在鳞癌患者中观察到miR-196a2基因多态性与肺癌预后有关，含C基因型提示肺癌预后较好。在接受化疗和手术的患者中观察到miR-608基因多态性与肺癌预后有关，且含C基因型提示预后较差。分层分析未观察到miR-146a和miR-423基因多态性与肺癌预后的关系。　　(3)联合作用结果　　miR-149和miR-196a2在鳞癌患者中存在联合效应，随着miR-149和miR-196a2的C等位基因个数的增加效应增强。miR-149的含C基因型和miR-608的含G基因型的基因的联合作用存在于接受化疗和手术的患者中。　　(4)5个SNP与肺癌组织中成熟miRNA表达量的关系　　miR-149含C基因型、miR-146a含G基因型、miR-196含C基因型可增加成熟miRNA的表达量，miR-423和miR-608的基因多态位点与相应成熟miRNA的表达量无关。　　(5) miR-27a和miR-30c-1基因多态性与肺癌预后的关系　　miR-30c-1的含G基因型，miR-27a的含C基因型是肺癌预后的独立影响因素，且提示预后较差，经分层分析结果发现，在多个亚组中两者与肺癌预后的关系具有统计学意义，且两者具有联合作用，含突变等位基因数量越多，患者预后越差。　　3、功能研究结果　　(1) miR-149 rs2292832与A549细胞成熟miRNA表达量的关系　　含C等位基因的细胞miR-149的表达量约是含T等位基因的细胞miR-149的表达量的1.55倍。　　(2) miR-149 rs2292832与细胞增殖和细胞周期的关系　　含C等位基因的细胞增殖能力弱于含T等位基因的细胞。含C等位基因的细胞其细胞周期与含T等位基因的细胞其细胞周期比较，存在G1/S阻滞。　　(3)双荧光素酶报告系统检测结果　　导入TOP1-3 UTR区和miR-149短片段的细胞其相对荧光素酶活性要低于其他三个对照组，即导入TOP1-3 UTR区和NC mimics组，导入TOP1-3 UTR突变体和miR-149 mimics组，导入TOP1-3 UTR区突变体和NC mimics组。　　(4) miR-149 rs2292832位点与TOP1基因表达的关系　　miR-149基因多态性与TOP1基因的mRNA表达量无关，但与TOP1蛋白表达量水平有关。含C等位基因的细胞TOP1蛋白表达量低于含T等位基因的细胞。　　(5) miR-149 rs2292832位点对顺铂处理敏感的影响　　含C等位基因的细胞比含T等位基因细胞对0.977ug/ml，62.5ug/ml，125ug/ml，500ug/ml浓度的顺铂处理更敏感，而对3.906ug/ml和250ug/ml浓度的顺铂处理较不敏感。　　结论:miR-149、miR-196a2、miR-608、miR-27a和miR-30c-1基因多态性与肺癌预后有关，且miR-149、miR-27a和miR-30c-1是肺癌预后的独立影响因素。 miR-149、miR-196a2的C等位基因具有联合作用，可提示肺鳞癌患者的良好预后。miR-149的C等位基因与miR-608的G等位基因具有联合作用，可提示接受化疗和手术患者的预后。miR-27a的C等位基因和miR-30c-1的G等位基因具有联合作用，可提示肺癌的不良预后。miR-149含C基因型、miR-146a含G基因型、miR-196含C基因型可增加成熟miRNA的表达量。miR-149的表达量增高可抑制TOP1蛋白的表达量，但对TOP1基因的转录没有影响。含miR-149的C等位基因的细胞其细胞增殖能力减弱，细胞周期存在G1/S阻滞，并且对顺铂的敏感性与处理浓度有关。