研究背景与目的：据《全国第三次死因调查》显示：我国恶性肿瘤变化的趋势有三个特征：1.食管癌、胃癌、宫颈癌、鼻咽癌死亡率及其构成呈明显下降趋势,其中宫颈癌下降幅度最大；2.与环境、生活方式有关的肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌死亡率及其构成呈明显上升趋势,其中肺癌和乳腺癌上升幅度最大,过去30年分别上升了465%和96%。3.从城乡前十位恶性肿瘤构成来看,肺癌已代替肝癌成为我国恶性肿瘤死亡原因第一位(占全部恶性肿瘤死亡的22.7%)。在全球,肺癌的发病率和死亡率也是居各种癌症前位,根据第38届美国临床肿瘤学会年会报告的统计数据,肺癌每年约造成全球140万人死亡,并且每年均呈上升态势。肺癌早期多无明显症状,尤其是占肺癌约80%的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC),65%-80%的患者确诊时已属中晚期,有远处病灶转移,常失去外科手术和放疗机会；因此,在肺癌的治疗方面,药物的作用就尤为重要。遗憾的是,目前对于肺癌的药物治疗,还缺乏持久有效的治疗药物,许多抗癌药物,即便是新兴的分子靶向治疗药物,尽管有其特异性强、毒性作用小等优势,但也因其局限的适用指征,故并不适合多数肺癌患者。经过长期的临床研究,国际癌症组织推荐了以顺铂为基础的联合化疗方案,这一直是晚期非小细胞肺癌的一线标准化疗方案。常用的有顺铂联合依托泊苷,或联合阿霉素、紫杉醇等；多项Ⅲ期随机临床试验和重要的协作组织研究及荟萃分析显示,不同的含铂方案疗效近似,而目前还没有总体疗效优于含铂方案的其他化疗方案。不过,随着铂的广泛应用,不可避免地引起肿瘤细胞对其产生耐药性,使化疗效果明显降低。这是当前困扰肺癌治疗的一大难题。我们知道,肿瘤之所以难治,究其原因,除了药物的毒副作用外,更重要的一点是肿瘤产生的多药耐药性,这是治疗的一大难题。美国国家癌症协会发布的研究数据指出：在肿瘤年死亡率中,属内在性多药耐药的肿瘤所致死者约占61%,属获得性耐药的肿瘤所致死者约占33%,也就是说,90%以上肿瘤患者化疗失败致死的原因都与耐药有关。这不仅对传统的化疗药,即便是最新的被认为具有划时代意义的小分子靶向治疗药物(如酪氨酸激酶信号传导通路抑制剂),上市不久也已发现有大量的耐药现象。所以说,肿瘤对化疗的耐药性是影响治疗的主要原因；寻找逆转肿瘤耐药性的药物已成为当前抗肿瘤的关键,也是当前抗肿瘤研究的热点。同样,寻找逆转肺癌对铂耐药的逆转剂是临床治疗肺癌的关键。遗憾的是,当前对于肿瘤细胞对铂类药物耐药性形成的机制还不清楚,一些研究表明,某些肿瘤细胞对顺铂的耐药与细胞中铂含量的降低有关,但是也有数据表明对顺铂耐药的肿瘤细胞中铂含量并未发生变化,目前还没有合适的铂类药物逆转剂应用于临床。近来有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor, HDACi)的研究进展颇令人振奋。这是一类以组蛋白去乙酰化酶为作用靶点的化合物,对恶性增殖细胞具有选择性抑制生长和诱导凋亡作用；不仅如此,最新的研究发现HDACi还具有逆转肿瘤多药耐药性的效果,能显著逆转卵巢癌和大肠癌细胞对顺铂、5—FU的耐药性,充分显示出HDACi是一类极具潜在研发价值的肿瘤多药耐药逆转剂。组蛋白有五种主要的分型,它们具有高度的结构相似性,其氨基末端区域可以通过翻译后修饰加入乙酰基(在赖氨酸基团上),这种乙酰化的结果直接导致组蛋白网状正电结构减少,弱化了组蛋白与DNA的结合,使核小体结构舒展,从而激活基因的转录。细胞内调节组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的酶：组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC),二者的动态平衡控制着染色体的结构和基因的表达。大量的研究证明,HDAC作为调控基因表达的关键酶,其功能的异常与肿瘤的发生、发展有直接关系。因此组蛋白去乙酰化酶被认为是最具潜力的癌症治疗药物靶点之一。2006年美国FDA正式批准了SAHA作为第一个组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抗癌新药,目前还有十多个化合物正在进行临床试验。综上所述,我们认为组蛋白去乙酰化酶抑制剂有望成为新型的多药耐药逆转剂,为此我们应用人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP为模型,选用具有代表性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A (Trichostatin A, TSA)和丙戊酸(Valproic acid,VPA)进行逆转顺铂耐药性的研究,并对其作用机制进行探讨,为临床治疗肺癌提供了新的思路及新的方法。研究内容及方法：本研究主要分两部分内容开展1.探讨HDACi是否具有逆转人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP对顺铂耐药性的作用：实验以MTT法检测人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP对顺铂的耐药倍数,检测TSA或VPA和顺铂联用对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用；以流式细胞技术检测联合用药对细胞凋亡以及细胞周期的影响；以β-半乳糖苷酶染色观察联合用药对细胞衰老的诱导作用；以基因芯片技术分析联合用药对细胞周期相关基因表达的调节作用,进一步采用Western blot法在蛋白水平上确证其对相关蛋白表达的影响。2.根据第一部分的研究结果,第二部分实验从细胞衰老的角度探讨HDACi诱导细胞衰老,逆转细胞对铂类药物耐药性的作用机制：以Western Blot研究HDACi对细胞衰老诱导通路INK4a/ARF/RB的调节作用；并以INK4a/ARF/RB基因通路上游调节通路Polycomb Group (PcG)蛋白调节复合物为靶点,进一步探讨HDACi的作用机制。结果：1.顺铂对人非小细胞肺癌A549细胞株的IC50为6μmol/L,耐药株A549/DDP的IC50为35μmol/L,耐药倍数为5.83倍；TSA和VPA单用均有明显的抑制A549/DDP耐药株生长的作用,TSA对A549/DDP耐药株的IC5o为193nmol/L; VPA的IC50为7mmol/L2.TSA或VPA联合顺铂对A549/DDP细胞生长的抑制效果明显高于药物单用组。3.细胞周期实验显示TSA联合顺铂显著升高G2/M期细胞数目比例(p<0.01),呈现G2/M阻滞现象。4.β-半乳糖苷酶染色实验显示经TSA联合顺铂处理后,A549/DDP细胞形态变得大而扁平、颗粒物质增多,β-半乳糖苷酶染色呈阳性,表明细胞发生衰老样变。5.基因芯片结果显示TSA联合顺铂处理后,受测基因中p21基因明显升高；Western blot结果与基因芯片结果相符,证明TSA具有显著促进p21表达的作用。6.TSA联合顺铂可以显著升高A549/DDP细胞内p16、p14蛋白表达。7.顺铂耐药株A549/DDP的PcG蛋白(EZH2, SUZ12, RBAP46/48,EED, CBX7,BMI-1,RING1B)以及p-RB蛋白表达明显高于A549。8.顺铂具有诱导A549、A549/DDP细胞PcG、p-RB蛋白表达升高的作用。9.TSA能有效降低A549/DDP细胞内的PcG、RB以及p-RB的表达。结论：1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA、VPA明显增强肺癌耐药细胞对顺铂的敏感性,具有逆转细胞耐药的作用。2.TSA联合顺铂使A549/DDP细胞发生G2/M期阻滞,诱导细胞发生衰老。3.TSA能上调p21、p16、p14的表达,降低RB、p-RB的表达,显示TSA通过INK4a/ARF/RB通路诱导A549/DDP细胞衰老,从而逆转细胞对顺铂的耐药性。4.顺铂可以诱导细胞内PcG蛋白表达,PcG蛋白在顺铂耐药株A549/DDP中呈现高表达,显示PcG蛋白可能参与了A549/DDP顺铂耐药性的形成与维持过程；TSA能明显抑制PcG蛋白的表达,显示TSA逆转肿瘤顺铂耐药性与PcG蛋白有关。