受精卵在子宫体腔以外着床称为异位妊娠(ectopic pregnancy,EP),习称宫外孕(extrauterine pregnancy)[1]。EP是妇产科常见的急腹症,发病率约1～2%,仍然是早期妊娠妇女发病和死亡的主要原因之一[2,3],其中又以输卵管妊娠最为常见,约98%发生在输卵管[2]。近些年来,随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的蓬勃发展,其常见的并发症异位妊娠也随之增加[4],严重威胁育龄妇女的生命健康。现代诊疗技术的发展使异位妊娠得以在早期就能及时发现,非手术治疗的机会增加,为有生育需求的患者提供了更多保全生育功能的机会。中医古籍中并无异位妊娠病名的记载,按其临床表现,可散见于“妊娠腹痛”、“经漏”、“妊娠下血”、“少腹瘀血”、“癥瘕”等病名中,现代中医在《中国医学百科全书·中医妇科学》中,通用“异位妊娠”或“宫外孕”之病名,中医学认为异位妊娠的发病机理与少腹宿有瘀滞,冲任、胞脉、胞络不畅,或先天肾气不足,后天脾气受损有关,其病机本质是少腹血瘀证[35]。采用活血化瘀、消癥杀胚方药治疗早期输卵管妊娠疗效确切。化瘀消癥复方是根据中医理论而制定,由丹参、赤芍、桃仁、天花粉、紫草五味药组成,方中丹参、赤芍、桃仁活血化瘀,共为君药,天花粉清热排脓消痈杀胚,紫草破血通络,杀胚消癥,二味辅佐君药以加强化瘀消癥杀胚之力,药味精简,临床疗效确切[57],最大限度保全了患者的生育能力。一、临床部分目的:在前期输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案研究的基础上,采用回顾性调查研究,从临床应用方面探讨输卵管妊娠的中西医结合诊疗方案的疗效和临床优势,进一步优化和改进治疗方案。研究方法:回顾性收集2012年1月至2015年12月输卵管妊娠患者药物治疗病例,按照西医药物保守治疗范围进行分组,分为常规组和超范围组,通过分析各组内β-HCG值对治疗结局的影响及对比两组间的有效率,探讨输卵管妊娠中西医结合诊疗方案的中医临床优势,并优化治疗方案。研究结果:(一)纳入病例情况:根据诊断标准、纳入标准及排除标准,2012年1月至2015年12月共收集符合中西医结合药物治疗规范的输卵管妊娠病例664例,其中常规组528例,超范围组136例。(二)超范围组136例中总有效率62.5%;常规组528例中总有效率77.8%。两组间有效率差异有统计学意义(P<0.05)。其中药物保守治疗无效转手术治疗的所有患者均手术成功,并临床治愈。由此可见,中西医结合药物治疗规范的治疗适应症范围要较西医的药物治疗适应症范围广,可以减少60%以上的手术概率,为患者提供了更多再生育的机会。(三)超范围组中根据血β-HCG值比较,HCG值<2000的有效率为85.9%;HCG值 2000～5000 的有效率 45.5%;HCG 值 5000～8000 的有效率 44.4%;HCG 值>8000 的共8例,仅1例有效,有效率12.5%。HCG值超过8000时,输卵管妊娠发生破裂的风险极高,且本研究亦证明其药物保守治疗疗效低,仅1例有效,基于临床安全性和有效性考虑,建议优化目前的中西医结合药物治疗方案,即当首次β-HCG值大于8000IU/L时,不论病情影响因子评分为多少,均建议手术治疗。二、实验部分目的:本研究拟以化瘀消癥复方为对象,针对发生早期输卵管妊娠的重要病理环节,以体外培养的妊娠滋养细胞为研究载体,运用正交设计表L18(35)进行配伍研究,结合正交设计与多目标指标分析,整合中药分析、药理、分子生物学技术等手段,系统研究化瘀消癥复方的药效,阐述其药物组成的配伍规律,寻找其最佳组合及剂量(优化处方)。方法:(一)人源妊娠滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞的培养,免疫荧光细胞化学染色法进行细胞鉴定。采用CCK8法检测经化瘀消癥复方(A水提、B醇提、C醇提后药渣水提、D醇提+水提)对人源妊娠滋养细胞系HTR-8/SVneo的增殖情况,采用流式细胞术检测48 h后细胞凋亡情况,设甲氨蝶呤组为阳性对照组,未经药物处理的细胞为空白对照组。(二)运用正交设计表L18(35)进行配伍研究,分别通过流式细胞术及RT-qPCR技术检测化瘀消癥复方不同配伍的各组药物对妊娠滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响,然后通过SPSS软件对实验结果进行正交设计方差分析。(三)采用Western Blot及RT-qPCR法检测化瘀消癥复方优选方不同药物浓度对滋养细胞系 HTR-8/SVneo 细胞 Bax、Fasl、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 蛋白及基因表达的影响。研究结果:(一)成功复苏和培养了人源妊娠滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞,免疫荧光细胞化学染色法鉴定结果显示细胞胞浆中有CK-18、ErbB 2阳性信号,未见波形蛋白信号;化学发光法功能鉴定有HCG的分泌。(二)CCK8法测定结果表明,与阴性对照组相比,不同方法提取的中药复方对HTR-8/SVneo细胞作用后对其增殖均有抑制作用,见图1;其中A组抑制率大于B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05),MTX组优于A、B、C、D组,差异有统计学意义(P<0.05)。(三)Hoechst染色法观察除阴性对照组以外的各组中均出现不同程度细胞体积缩小,细胞皱缩,核固缩,核碎裂及凋亡小体,以A组和MTX组最明显。(四)流式细胞检测示:各组药物作用于HTR-8/SVneo细胞后其凋亡率分别为(34.067±1.401)%(A 组),(20.933±5.900)%(B 组),(22.233±4.869)%(C组),(27.5±5.047)%(D 组),(36.133±0.493)%(MTX 组),与空白对照组(3.6±0.529)%(K组)相比,各组凋亡率均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);其中A组凋亡率高于B组、C组,MTX组高于D组,差异均有统计学意义(P<0.05);A组与D组、MTX组与A组差异无统计学意义(P>0.05)。(五)正交设计方差分析结果:除紫草以外,丹参、赤芍、桃仁、天花粉这四个药物因素对HTR-8/SVneo细胞凋亡率的影响差异均有统计学意义(P<0.01),其影响程度的大小依次为:赤芍>桃仁>丹参>天花粉>紫草;除桃仁以外,其他四味药对Caspase-3基因表达的影响差异有统计学意义(P<0.05),其影响程度的大小依次为:天花粉>丹参>赤芍>紫草>桃仁;五味药对Caspase-9基因表达的影响差异均有统计学意义(P<0.01),其影响程度的大小依次为:天花粉>丹参>紫草>赤芍>桃仁。各药物不同水平的组间差异:对凋亡率的影响,A3>A2>A,(P<0.05),B3>B2>B,(P<0.05),C3>C2>C,(P<0.05),D3>D2、D,,(P<0.05),D2与D1之间差异无统计学意义(P>0.05);E2>E1>E,差异无统计学意义(P>0.05);对Caspase-3基因表达的影响,A3、A2>A,(P<0.05),A3与A2差异无统计学意义(P>0.05),B2、B1>B3(P<0.01),B2与B1差异无统计学意义(P>0.05),C2>3>C1差异无统计学意义(P>0.05),D2>D3>D1(P<0.01),E1>E2(P<0.01),E2与E3、E1与E3差异无统计学意义(P>0.05);对 Caspase-9 基因表达的影响,A2>A3>A1(P<0.01),B2>B3、B1(P<0.01),B3与B1差异无统计学意义(P>0.05),C2、C1>C3(P<0.05),C2与C1差异无统计学意义(P>0.05),D3>D2、D1(P<0.01),D2与D1之间差异无统计学意义(P>0.05),E2>E1>E3(P<0.01)。(六)Western-blot和RT-qPCR检测:与阴性对照组相比,优选方低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组均能明显上调HTR-8/SVneo细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和Fasl蛋白的表达。优选方高、中剂量组及甲氨蝶呤组均能明显上调HTR-8/SVneo细胞 Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 和 Fasl mRNA 的表达;优选方低剂量组能明显上调 HTR-8/SVneo 细胞 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 和 Fasl mRNA 的表达。结论(一)中西医结合治疗输卵管妊娠疗效确切,超西医药物保守治疗范围同时符合中西医结合药物治疗的成功率较高。(二)当首次β-HCG值大于8000IU/L时,不论病情影响因子评分为多少,均建议手术治疗。(三)化瘀消癥复方以水提法为最佳提取方法。(四)通过正交设计方差分析筛选出化瘀消癥复方最佳配伍优选方为:丹参15g、赤芍15g、桃仁15g、天花粉30g、紫草15g。(五)化瘀消癥复方优选方作用于妊娠滋养细胞后,均可上调Fas/FasL、Bcl-2/Bax凋亡通路相关蛋白的表达,提示化瘀消癥复方可能通过诱导Caspase介导的死亡受体及线粒体凋亡通路而促进滋养细胞凋亡。