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肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是肝脏对酒精、药物、病毒感染、自身免疫失衡等细胞损伤因素而产生的一种可逆的愈合反应,为慢性肝病共有的病理改变,主要表现为以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内大量沉积并伴有肝脏损伤,如果不加以控制,肝纤维化可发展为肝硬化甚至肝癌,严重威胁人类健康。探讨肝纤维化形成过程中的机制对慢性肝病的治疗具有重要的意义。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)与肝纤维化发生发展过程存在着密切的联系,HSCs细胞的激活对肝纤维化的形成有着重要的作用。激活的HSCs细胞转化形为肌成纤维细胞(Myofibroblast-like cells,MFBLC),并分泌大量的胶原,最终导致肝纤维的形成。作为肝纤维化发生的主要效应细胞之一,促进增殖的HSCs发生凋亡已成为防治肝纤维化有效途径。大量研究证实,自噬(Autophagy)在肝纤维化形成过程中发挥着重要的作用,自噬与HSCs细胞的凋亡也存在密切的联系。同时,研究表明,HSCs细胞的激活能够促进细胞钙离子(Ca2+)内流,抑制HSCs细胞Ca2+内流对促进活化的HSCs细胞发生凋亡具有重要的意义。并且,研究证实Ca2+浓度的变化对细胞自噬也起着重要的调节作用。课题组前期研究证实,非选择性Ca2+瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(Transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)在肝纤维化形成中发挥着重要的作用。本课题重点研究TRPV4对大鼠HSC-T6的作用,为肝纤维化的治疗提供新的靶点。主要研究内容概括如下:1.TRPV4在大鼠肝星状细胞中的表达情况及对大鼠肝星状细胞凋亡蛋白的影响实验采用大鼠HSC-T6细胞系为研究对象,用浓度为10ng/ml TGF-?1处理细胞24h,实时定量PCR(qRT-PCR)、Western blot检测TRPV4的mRNA和蛋白的表达水平,检测结果显示,与未处理组相比,TGF-?1处理后,TRPV4的mRNA和蛋白水平明显升高。提示TRPV4在大鼠HSC-T6细胞中增殖、活化过程中可能发挥着重要的作用。采用lipofectaminetm2000介导的sirna技术特异性沉默大鼠hsc-t6细胞内trpv4,首先通过流式细胞技术观察大鼠hsc-t6细胞凋亡情况,并采用qrt-pcr、westernblot检测bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。qrt-pcr、westernblot结果显示,与tgf-?1处理组相比,特异性阻断trpv4的表达,可明显提高bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平。流式结果显示,与tgf-?1处理组相比,特异性阻断trpv4的表达,可明显促进大鼠hsc-t6细胞凋亡蛋白的表达。与之相应的,通过trpv4的特异性激动剂1um4α-pdd激活trpv4,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明显下降。提示,在细胞活化的过程中,trpv4可以抑制凋亡蛋白的表达,可能起到调控细胞凋亡的作用。2.自噬在大鼠hsc-t6细胞中的水平及trpv4对自噬水平的影响机制研究qrt-pcr、westernblot检测显示,与未处理组相比,tgf-?1处理后,lc3的mrna和蛋白水平明显升高,p62的mrna和蛋白水平明显降低。特异性阻断trpv4,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,lc3的mrna和蛋白水平明显降低,p62的mrna和蛋白水平明显升高,吖啶橙染色结果显示,自噬小泡明显减少。激活trpv4后,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,lc3的mrna和蛋白水平明显升高,p62的mrna和蛋白水平明显降低,吖啶橙染色结果显示,自噬小泡明显减少。为了进一步研究trpv4对自噬的调节机制,大量文献证实,akt通路是自噬的经典上游通路。通过特异性阻断trpv4,westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,p-akt蛋白表达水平明显降低。以上结果提示,在细胞活化的过程中,trpv4可能是通过激活akt通路继而上调自噬。3.在大鼠hsc-t6细胞中自噬对凋亡蛋白表达的影响使用自噬抑制剂氯喹抑制自噬的水平,qrt-pcr、westernblot检测结果显示,与tgf-?1处理组相比,bax、caspase3mrna水平以及bax、pro-caspase3蛋白水平明显升高。提示在大鼠hsc-t6细胞中,抑制自噬水平可明显促进凋亡蛋白的表达。为了进一步探讨TRPV4与自噬和凋亡蛋白变化之间的关系。我们发现,在抑制自噬的基础上激活TRPV4,与TRPV4不处理组比较,凋亡蛋白没有明显的变化。证实TRPV4可能是通过激活自噬进而抑制凋亡凋亡蛋白的表达。