一、研究背景蜱是一种专性吸血性节肢动物,在全球范围内广泛分布。蜱几乎可以叮咬陆地上所有的动物,并且吸血时间长、吸血量大、生活史复杂。这些特点使蜱携带的病原体种类较为广泛,包括病毒、细菌、真菌、原虫等。蜱作为人兽共患病的重要媒介,能够将病原体传播给人类、牲畜和野生动物。斑点热群立克次体（spotted fever group rickettsia,SFGR）是蜱媒传染病中重要的一类病原体,可在世界范围内引起严重威胁人类健康的人兽共患的自然疫源性疾病。随着分子生物学技术的不断发展,越来越多的新斑点热群立克次体被发现,但由于分离技术的局限性,目前获得的立克次体分离株较少,暂时无法开展有效的体外实验。但要研究立克次体与节肢动物媒介之间的联系以及与宿主动物之间的关系,还有动物感染与人群感染之间的差异以及不同的立克次体之间的致病性的差异和宿主细胞之间的相互作用关系,获得立克次体的分离株必不可少。而且目前有许多研究人员都在蜱中检测到了多种立克次体的存在,并且还存在于多种蜱种中检测到同一种病原体情况。因此,获得立克次体的分离株,并对其生物学特征进行研究,结合基因组学的分析,有助于了解立克次体的感染情况以及作用的途径和机制,对于立克次体对人类和宿主动物的危害提供有效的防治措施。二、研究目的（1）通过体外细胞分离技术,于蜱标本中获得新SFGR的分离株。（2）基于分子流行病学调查,了解新SFGR的分布情况,评估其对公共卫生健康的危害性。（3）根据SFGR在体外实验中表现出的生物学特征,掌握其在宿主细胞中的毒力作用和潜在致病性。（4）根据全基因组序列分析,了解新SFGR的基因组特征以及和毒力相关的基因。三、研究内容（1）对采集到的蜱进行新SFGR的分离,获得新SFGR的分离株,并通过分子生物学技术,了解其与其他立克次体的进化关系。（2）对自然环境中的蜱进行检测,了解新SFGR在不同地区不同蜱种的分布情况,探讨其流行病学特征。（3）根据体外实验,了解新SFGR的生物学特征,探讨其与宿主动物之间的关系以及潜在的致病性。（4）对获得的全基因组序列进行分析,从基因层面了解SFGR的基本特征、毒力基因以及潜在的致病性。四、研究方法（1）将采集到的蜱进行形态学鉴定后,选择部分生长状态良好的蜱于不同的细胞系中进行分离。然后通过吉姆萨染色和荧光定量PCR检测,确定其可在细胞中稳定生长。对于成功分离到的SFGR进行特异性片段分析,确定其进化关系。（2）通过新SFGR的特异性基因检测方法,对我国多个地区采集的蜱标本进行检测,并对新SFGR的其他特异性基因片段进行扩增并构建遗传进化树。（3）通过超薄切片电镜观察新SFGR的形态学以及增殖分裂的特征。绘制新SFGR在不同细胞系的生长曲线,描述其生长情况。通过感染Vero81细胞和HUVEC细胞,观察其致细胞病变效应（CPE）、空斑效应以及肌动蛋白细胞骨架运动学结果。（4）对新SFGR的全基因组进行分析,了解其基本特征。比较其毒力基因差异。结合肌动蛋白细胞骨架运动学结果,分析与肌动蛋白相关的结构域差异。通过比较基因组,了解其与近缘立克次体种的基因插入或缺失。五、研究结果（1）分离到一株新斑点热群立克次体将采集到的蜱进行形态学鉴定,结果为微小扇头蜱、血红扇头蜱、台湾血蜱等多个蜱种。将实验室现存的活蜱进行接种,结果在来源于同一母蜱的微小扇头蜱幼蜱的接种物中检测到一株新斑点热群立克次体。经过一段时间的培养后,发现该立克次体可在不同细胞中稳定生长,并通过吉姆萨染色,可在细胞中看到有立克次体的存在,而且通过实时荧光定量PCR可检测到立克次体的含量在缓慢增加。对于成功分离到的SFGR进行特异性片段分析,发现与其亲缘关系较近的是Candidatus Rickettsia longicornii isolate ROK-HL727和Rickettsia sp.isolated XY118。（2）新SFGR的分子流行病学调查从全国共采集到570只蜱,经形态学鉴定为3个属8个蜱种。筛查蜱中SFGR的分布情况,总的感染率为17%（96/570）,而且在不同地区不同蜱种中,SFGR的感染率不同。在所有采样的地点中,贵州、云南、福建、广西、四川、广东、新疆、内蒙古等地区均有SFGR的感染。在所有检测的8个蜱种中,微小扇头蜱、长角血蜱、猛突血蜱、森林革蜱、草原革蜱、边缘革蜱等蜱种均有SFGR的感染。通过对不同地区不同蜱种中的SFGR的不同基因片段进行进化树的构建,发现基因片段均无差异。通过对采样点的准确定位,考虑其所处的生境,发现新SFGR所分布的生境均属于山区丘陵地带,因此将其命名为Rickettsia hills（R.hills）。（3）R.hills的生物学特征研究通过超薄电镜观察立克次体的形态和增殖情况发现,R.hills切面呈杆状、圆形或椭圆形等形态,具有典型的双层膜结构,主要分布在细胞质中,并在细胞质中以二分裂的方式进行增殖。根据绘制R.hills在不同细胞系上的生长曲线发现,R.hills可在Vero81、HUVEC、IDE8细胞中生长,并且在IDE8中的载量高于Vero81、HUVEC,提示其可能会感染人群和宿主动物。通过比较不同斑点热群立克次体的致细胞病变效应,发现R.hills在观察时间内并未产生细胞病变,细胞毒性较小。比较不同斑点热群立克次体的空斑实验发现,R.hills在观察时间内并未产生空斑。用phalloidin染色定位肌动蛋白,发现R.hills感染HUVEC单层细胞后未出现肌动蛋白尾。（4）R.hills的基因组特征研究对分离出的立克次体,我们进行了三代测序,并用二代数据对基因组进行矫正后,获得了完整的R.hills基因组,基因组全长1,468,126 bp,G+C含量32.3%,共有基因1663个。对全基因组序列进行系统进化树分析,发现其与其他现有立克次体不同,证实获得的分离株为新SFGR。通过对R.hills基因组中毒力基因的识别,发现其中的sca2基因截断,与完整的sca2基因相比,缺失了基因前40%的片段。同时并没有发现R.hills在肌动蛋白的结构域上与其他物种存在显著差异。同时还发现在R.hills相较于其亲缘关系最近的R.japonica存在150 kb的插入。六、研究结论（1）从云南微小扇头蜱中分离到一株R.hills,并明确了进化地位。（2）R.hills在我国不同地点不同蜱种中均有分布,分布范围较为广泛。（3）R.hills在Vero81细胞中并未产生细胞病变效应和空斑,体外细胞感染的立克次体缺乏以肌动蛋白细胞骨架介导的细胞间运动性。（4）发现R.hills基因组中的sca2基因截断,并且R.hills相较于其亲缘关系最近的R.japonica存在150 kb的插入。七、研究意义与创新性本研究从云南微小扇头蜱中分离到一株新SFGR,丰富了新发SFGR的种类,在未发现其与人类感染有关之前对其生物学特性和基因组特征进行了初步研究,为研究其致病机制以及蜱、宿主、病原体之间的相互作用等方面奠定了基础。