研究背景 卒中可引起脑局部及全身的各种病理生理改变,而Treg细胞和Th17细胞在卒中后的病理过程中扮演者重要角色。Th17/Treg平衡的改变对卒中后局部和全身的免疫环境均有着重要的影响。人体内约2%的基因编码蛋白,而90%以上的基因都存在转录活性但不具备翻译功能,被称为非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）。目前,nc RNA研究比较多的有micro RNA（miRNA）和lnc RNA（long nocoding RNA）。micro RNA是一类长度约为19-25nt的非编码RNA,它们的序列具有高度保守性,表达具有时间和组织的特异性。lnc RNA是一类长度超过200nt的长链非编码RNA分子,能够通过RNA-RNA碱基配对、RNA-蛋白作用、RNA-DNA作用等不同的作用机制,在基因表达调控的各个层面发挥功能,包括染色质修饰、转录调节、RNA的剪切加工及其稳定性调节等过程。越来越多的研究表明,包括lnc RNA和micro RNA在内的nc RNA不仅参与各种细胞生物学过程,维持机体正常生理功能,也在各种疾病中扮演着重要角色。目前,已有研究者对nc RNA在卒中后参与调节T细胞的功能及分化等方面进行研究,并取得一定的证据。但我们推测也会存在其他的调节机制。第一部分目的 检测MCAO模型和假手术模型中各可能参与调控Th17和Treg分化的关键分子,分析它们在卒中条件下调控Th17和Treg的分化中的可能机制。方法小鼠随机分为两组,每组3只。其中一组进行MCAO建模,另一组进行假手术建模。两组小鼠建模24小时后麻醉取眼血。PCR检测两组小鼠外周血液样本中的调控Th17和Treg分化的关键通路上的关键分子。根据PCR的结果,选择表达差异明显、稳定的分子为研究对象。再次使用PCR的方法检测两组小鼠血液样本中调控该分子的micro RNA的表达差异,选择表达差异明显、稳定的分子为研究对象,并检测调控它的lnc RNA在两组血液样本中的表达差异。随后检测两组小鼠的血液样本中,Th17的标志物RORγt和Treg的标志物foxp3的表达差异。同时流式细胞分析两组血液样本中Th17细胞和Treg细胞的比例,检测其分化及平衡。结果 PCR结果显示,与假手术组相比,MCAO组的外周血液中STAT3的相对表达量升高,Fox O1的相对表达量降低。两组SOCS3、PTEN、SMAD7和SMAD3的相对表达量差异无统计学意义。选取STAT3作为研究对象,并用PCR的方法检测调控STAT3表达的潜在的micro RNA的表达。与假手术组相比,MCAO组miR-30a、miR-1192和miR-495的表达显著减少。而miR-203的表达则升高明显。选择miR-1192作为研究对象,并用PCR的方法检测了调控miR-1192表达的潜在的lnc RNA的相对表达量。我们发现,与假手术组相比,MCAO组的RP23-261O3.1、RP23-402K24.2和C230088H06Rik的相对表达量差异无统计学意义,Gm4117的相对表达量则升高,差异有统计学意义。经过PCR检测,与对照组相比,观察组血液的RORγt的相对表达量升高明显,foxp3的相对表达量则降低,差异均有统计学意义。流式细胞检测显示观察组的Th17比例升高,Treg比例下降。Th17/Treg比值升高。结论 卒中建模之后,外周循环中的Th17比例升高,Treg比例下降。Th17/Treg比值升高。参与调控的诸多分子发生了改变,提示这些分子组成一个复杂的调控网络,最终调控Th17和Treg的分化。其中Gm4117-miR-1192-STAT3是一条可能的调控通路。第二部分目的 体外实验研究Gm4117在调控na?ve CD4+T细胞Th17和Treg的分化中的作用。方法 取小鼠脾脏制成单细胞悬液。使用磁珠分选法分选出na?ve CD4+T细胞。构建Gm4117的过表达和干扰等质粒。选取细胞,分为过表达组、过表达对照组、干扰组、干扰对照组和空白对照组,分别给予过表达慢病毒、过表达对照慢病毒、干扰慢病毒、干扰对照慢病毒、不给予任何慢病毒。随后将5组细胞各分为3小组。3个小组分别进行Th17极化培养、Treg极化培养和空白培养。使用PCR法检测在各种极化条件下,5组细胞的Gm4117、miR-1192和STAT3的相对表达量,用WB法检测5组细胞的IL-17和TGF-β的差异,用流式细胞技术检测了5组细胞在3种极化条件下Th17细胞和Treg细胞比例,比较5组细胞的Th17/Treg比值。检测Gm4117的干扰慢病毒和miR-1192抑制物共转染之后,Th17和Treg细胞比率,计算Th17/Treg比值,并用PCR法检测STAT3的相对表达量。WB法检测5组细胞的p-STAT3的水平,并比较其相对灰度值。STAT3不仅可直接调控na?ve CD4+T细胞的分化,还可以通过增加HIF-1信号通路的关键因子HIF-1α的表达来间接调控。所以分别使用PCR法和WB法检测了HIF-1α的表达和水平。使用PCR法和WB法检测了5组细胞的STAT3调控的凋亡相关蛋白Bcl-XL、Bcl-2、SOCS1、MCL1和PIM1的表达和水平,并用WB法检测Caspase-3的水平。结果 在各种极化条件下,5组的关键分子表达均呈类似的表现:过表达组的lnc-Gm4117和STAT3和干扰组的miR-1192的相对表达量均高于其他组;干扰组的lnc-Gm4117、和STAT3和过表达组的miR-1192相对表达量均低于其他组;干扰对照组、过表达对照组和空白组的lnc Gm4117、miR-1192和STAT3的表达则均居中,且相互之间差异无统计学意义。对5组细胞中的IL-17A、TGF-β水平的WB检测显示,过表达组的IL-17A显著升高,而TGF-β降低;干扰组的IL-17A显著降低,而TGF-β升高,相对灰度值的差异均有统计学意义。空白组、干扰对照组、过表达对照组的两种蛋白则居中,三组间差异无统计学意义。各种极化条件下,5组的Th17和Treg分化表现类似:过表达组Th17细胞比率均升高,Treg细胞比率均降低,Th17/Treg比值均升高;干扰组的Th17比率均降低,Treg细胞比率均升高,Th17/Treg均降低;干扰对照组、过表达对照组和空白组的Th17、Treg细胞比率和Th17/Treg比值则均居中,相互之间差异无统计学意义。Gm4117的干扰慢病毒和miR-1192抑制物共转染之后,与空白对照组相比,Th17和Treg细胞比率、Th17/Treg比值差异无统计学意义。STAT3表达的差异也无统计学意义。WB法检测5组细胞的p-STAT3的水平,相对灰度值比较结果表明,过表达组的pSTAT3相对灰度值升高,干扰组的p-STAT3相对灰度值降低,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。PCR检测5组HIF-1α的表达,结果显示过表达组的HIF-1α的表达升高,干扰组的HIF-1α的表达降低,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。WB法检测5组HIF-1α的水平,结果显示,过表达组的HIF-1α的相对灰度值升高,干扰组的HIF-1α的相对灰度值降低,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。PCR法检测5组STAT3调控的凋亡相关蛋白的表达,结果显示,过表达组的Bcl-XL、Bcl-2、SOCS1、MCL1和PIM1的表达升高,干扰组的Bcl-XL、Bcl-2、SOCS1、MCL1和PIM1的表达降低,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。WB法检测结果显示,过表达组的Bcl-XL、Bcl-2、SOCS1、MCL1和PIM1的相对灰度值升高,干扰组的Bcl-XL、Bcl-2、SOCS1、MCL1和PIM1的相对灰度值降低,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。WB法检测5组细胞Caspase-3的水平,结果显示,过表达组的Caspase-3的相对灰度值降低,干扰组的Caspase-3的相对灰度值升高,差异有统计学意义,其他3组差异无统计学意义。结论 过表达Gm4117可对miR-1192负性调节,消除后者对STAT3表达的负向调节的作用,最终调控na?ve CD4+T细胞向Th17方向分化。干扰Gm4117则对miR-1192进行正性调节,从而对STAT3的表达有负向调节的作用,最终调控na?ve CD4+T细胞向Treg方向分化,而这种调控作用可以被转染miR-1192抑制物所阻断。因此,Gm4117的这种调控Th17和Treg分化的作用很可能是通过其负向调节miR-1192的表达实现的。Gm4117调控Th17和Treg分化,除通过STAT3的直接调控作用外,通过HIF-1信号通路的间接调控作用也是可能存在的。另外,STAT3相关的抗凋亡蛋白的表达,使得这种调节Th17/Treg平衡的作用得到更好的维持。第三部分目的 体内实验研究Gm4117在调控na?ve CD4+T细胞的Th17和Treg分化中的作用。方法 小鼠3只一组随机分为5组,分为过表达组、过表达对照组、干扰组、干扰对照组和空白对照组,将相应慢病毒经尾静脉注射至小鼠体内。小鼠培养两周后,建立MCAO模型,用PCR的方法检测5组小鼠血液中Gm4117、miR-1192和STAT3的表达;用流式细胞术检测各组小鼠血液中Th17细胞和Treg细胞比率。WB检测5组小鼠外周血液中的IL-17A、TGF-β的水平。结果 过表达组的Gm4117和STAT3以及干扰组的miR-1192的相对表达量均增加,差异有统计学意义;干扰组的Gm4117和STAT3以及过表达组的miR-1192的相对表达量均降低,差异有统计学意义;干扰对照组、过表达对照组和空白组的Gm4117、miR-1192、STAT3的相对表达量则居中,且相互之间差异无统计学意义。过表达组Th17细胞比率升高,Treg细胞比率降低,Th17/Treg比值升高;干扰组的Th17细胞比率降低,Treg细胞比率升高,Th17/Treg比值降低;干扰对照组、过表达对照组和空白组的Th17细胞比率、Treg细胞比率和Th17/Treg比值则居中,且相互之间差异无统计学意义。对各组MCAO小鼠的血液使用WB检测相对灰度值进行统计学分析,结果显示,过表达组的IL-17A显著升高,而TGF-β的表达降低,差异有统计学意义;干扰组的IL-17A显著降低,而TGF-β的表达升高,差异也具有统计学意义。空白组、干扰对照组、过表达对照组的两种蛋白表达则居中,三组间差异无统计学意义。结论在体内,Gm4117同样可对miR-1192负向调节,从而减弱其对STAT3的负向调节作用,并调控na?ve CD4+T细胞向Th17方向分化。