子宫内膜癌（Endometrial cancer,EC）是常见的妇科恶性肿瘤,发病率和死亡率分别位于女性恶性肿瘤的第四位和第六位。随着子宫内膜癌尤其是子宫内膜样腺癌（Endometrial adenocarcinoma,EAC）发病率的上升和发病患者的年轻化,孕激素保守治疗已成为年轻患者保留生育功能的重要选择。研究显示,约55%的子宫内膜样腺癌患者经以孕激素为主的保守治疗后疾病完全缓解,然而47%的患者在7-36个月内复发;约有30%的子宫内膜样腺癌患者对孕激素治疗完全无反应,并在治疗过程中产生孕激素抵抗。因此,深入探讨子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的分子机制,改善孕激素抵抗和不良预后,有效筛选孕激素保守治疗的优势受益人群,成为临床亟待解决的难题。固醇调节元件结合蛋白 1（Sterol regulatory element-binding protein1,SREBP1）是调节胆固醇和脂质合成代谢的转录因子,通过与脂质合酶基因启动子或增强子的固醇调节元件结合,激活靶基因的转录。据报道,当肿瘤细胞内胆固醇减少时,SREBP1在内质网为前体形式,与SREBP-cleavage-activating蛋白质复合物（SCAP）,运输到高尔基体水解,释放SREBP1进入细胞核,并激活酶的转录,调节胆固醇和脂肪酸合成代谢。当胆固醇升高时,胰岛素诱导基因通过与SCAP结合阻断SREBP-SCAP从内质网向高尔基体的转运,减少脂肪酸和胆固醇的产生。研究显示,SREBP1在多种肿瘤中异常表达,包括前列腺癌、乳腺癌和肝癌。此外,SREBP1在子宫内膜癌中过度表达,其与肿瘤组织分化程度相关,且SREBP1促进子宫内膜癌的发生发展,但其与孕激素抵抗的关系尚不明确。本研究主要分为三部分实验:首先对子宫内膜样腺癌孕激素敏感细胞系和耐药细胞系mRNA-seq检测,筛选耐药相关分子SREBP1并在组织和细胞系中进行验证,分析SREBP1与子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的相关性;随后通过体内外实验探究不同SREBP1表达水平的细胞对孕激素敏感性的差异,确认SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素抵抗发生过程中发挥的具体作用,并进一步探究SREBP1抑制剂Fatostatin对逆转孕激素抵抗的作用;最后通过生物信息学及功能学实验初步揭示SREBP1诱导子宫内膜样腺癌孕激素抵抗发生的具体机制。第一部分SREBP1在孕激素抵抗子宫内膜样腺癌中的表达及意义研究目的检测SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素敏感及耐药细胞系和临床标本中的表达情况,探究SREBP1与子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的相关性。研究方法1.检测人子宫内膜癌样腺癌细胞系对孕激素的敏感性:通过MTT实验、EDU掺入实验、流式细胞凋亡学实验检测孕激素敏感细胞系、原发性及继发性孕激素耐药细胞系对孕激素的敏感性。2.检测SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素敏感和耐药细胞系中的表达:在GEO数据库中下载孕激素敏感细胞与耐药细胞的mRNA测序数据集,应用R语言分析孕激素敏感和耐药细胞中SREBP1的mRNA表达;通过WB实验验证SREBP1蛋白在孕激素敏感、原发和继发性孕激素耐药细胞系中的表达量,并检测孕激素处理后SREBP1的变化情况。3.检测孕激素受体在孕激素耐药临床样本中的表达情况:通过IHC实验检测孕激素受体PGR在子宫内膜样腺癌患者接受孕激素保守治疗前后的临床样本中的表达,探究PGR的表达与患者临床转归的相关性。4.检测SREBP1在孕激素耐药临床样本中的表达情况:通过IHC检测SREBP1在子宫内膜样腺癌患者接受孕激素保守治疗前后的临床样本中的表达情况。研究结果1.人子宫内膜样腺癌细胞系对孕激素的敏感性:筛选原发性孕激素敏感细胞系Ishikawa及原发性孕激素耐药细胞系HEC-1A,与前期本课题组构建的继发性孕激素耐药细胞系IshMR进行后续实验;在同等浓度MPA作用下,与孕激素耐药细胞IshMR及HEC-1A相比,孕激素敏感细胞Ishikawa的存活力、增殖力明显下降,细胞凋亡明显增多,Ishikawa对MPA的敏感性显著高于IshMR和HEC-1A。2.SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素耐药细胞系中高表达:SREBP1在孕激素耐药细胞IshMR及HEC-1A中表达较敏感细胞Ishikawa增高,且MPA处理后,耐药细胞中SREBP1表达进一步增高。3.PGR在孕激素耐药临床样本中低表达:经IHC实验检测发现,临床预后判定为完全缓解组及部分缓解组的PGR呈明显阳性表达,且孕激素治疗前后无明显差异,而疾病进展组几乎不表达,表明PGR的表达水平与临床预后结果基本一致。4.SREBP1在孕激素耐药临床样本中高表达:经IHC实验检测发现,完全缓解及部分缓解组的SREBP1均为低表达,而疾病进展组SREBP1相对高表达,且治疗后SREBP1表达进一步增高。研究结论1.SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素耐药临床标本和细胞系中高表达。2.SREBP1与子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的发生发展具有相关性。第二部分SREBP1在子宫内膜样腺癌孕激素抵抗发生发展中的作用研究目的1.探究靶向处理SREBP1后,子宫内膜样腺癌细胞对孕激素敏感性的变化情况。2.探究SREBP1抑制剂Fatostatin与孕激素联合应用逆转子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的可行性。研究方法1.检测SREBP1过表达对子宫内膜样腺癌恶性生物学行为及孕激素敏感性的影响:应用孕激素敏感细胞系Ishikawa构建SREBP1过表达及对照细胞系,加用不同浓度的MPA,通过MTT、EDU、凋亡、WB等体外实验及裸鼠成瘤体内实验验证过表达SREBP1对子宫内膜样腺癌恶性生物学行为的影响及对孕激素敏感性的变化情况。2.检测SREBP1敲低对子宫内膜样腺癌恶性生物学行为及孕激素敏感性的影响:应用原发、继发性孕激素耐药细胞IshMR和HEC-1A分别构建SREBP1敲低及对照细胞系,加用不同浓度的MPA,通过MTT、EDU、凋亡、WB等体外实验及裸鼠成瘤实验验证敲低SREBP1对子宫内膜样腺癌恶性生物学行为的影响及对孕激素敏感性的变化情况。3.检测SREBP1抑制剂与孕激素联合应用对子宫内膜样腺癌恶性生物学行为的影响:通过WB实验验证SREBP1抑制剂的抑制效应后,与MPA联合应用于孕激素耐药细胞系,在体内外实验中观察肿瘤的生长情况。研究结果1.SREBP1过表达能降低子宫内膜样腺癌对孕激素的敏感性:WB及PCR实验验证SREBP1过表达效率后,通过MTT、EDU、凋亡、WB等体外实验及裸鼠成瘤体内实验证明,在MPA处理下,过表达SREBP1能使孕激素敏感细胞系的增殖、迁移能力增强,凋亡细胞比例降低,促进肿瘤的生长。2.SREBP1敲低能增加子宫内膜样腺癌对孕激素的敏感性:WB及PCR实验验证SREBP1敲低效率后,通过MTT、EDU、凋亡、WB等体外实验及裸鼠成瘤体内实验证明,在MPA处理下,敲低SREBP1能使原发及继发孕激素耐药细胞系的增殖、迁移能力减弱,凋亡细胞增多,抑制肿瘤增长。3.SREBP1抑制剂与孕激素联合应用能增加孕激素对肿瘤的杀伤效应:通过WB实验验证SREBP1抑制剂的抑制效应后,通过MTT、单克隆及凋亡等体外实验与裸鼠成瘤体内实验证明,抑制剂与MPA联合应用能明显降低细胞的增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤的进展。研究结论1.在孕激素敏感细胞系中过表达SREBP1使细胞对孕激素敏感性降低,诱导孕激素耐药的发生。2.在原发性和继发性孕激素耐药细胞系中敲低SREBP1使细胞对孕激素敏感性增强,逆转孕激素耐药。3.SREBP1抑制剂与孕激素联合应用能使耐药细胞系对孕激素敏感性增强,加强孕激素对肿瘤的杀伤效应。第三部分SREBP1诱导子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的相关机制研究目的探究SREBP1诱导子宫内膜样腺癌发生孕激素抵抗的作用机制并反向验证进一步明确。研究方法1.筛选并验证SREBP1诱导子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的分子通路:通过对SREBP1过表达组和对照组细胞进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对其进行基因富集分析,初步确定SREBP1可能通过NF-κB通路诱导子宫内膜样腺癌孕激素抵抗。通过WB实验及免疫荧光实验验证转录组测序结果,并在细胞中加入MPA处理后进一步明确SREBP1激活NF-κB通路的可能性。2.检测NF-κB在孕激素耐药临床标本和细胞中的表达情况:通过IHC检测NF-κB在子宫内膜样腺癌患者接受孕激素保守治疗前后的临床样本中的染色情况;通过Ishikawa和IshMR转录组测序分析NF-κB通路的表达。3.通过抑制NF-κB通路进行反向回复实验验证:在过表达SREBP1及对照组细胞系中瞬时转染NF-κB小干扰以敲低NF-κB的表达,通过WB实验验证转染效率后,通过MTT、凋亡等实验验证细胞对孕激素的敏感性,WB实验检测增殖和凋亡相关蛋白的表达。研究结果1.过表达SREBP1激活NF-κB通路:对转录组测序结果进行KEGG富集,发现在过表达SREBP1细胞中NF-κB通路明显被富集;通过免疫荧光实验及WB实验发现,过表达SREBP1能激活NF-κB通路并促进其核移位,且加入MPA处理后该现象更明显。2.NF-κB通路在孕激素耐药细胞和组织中高表达:在耐药细胞IshMR中,NF-κB通路明显高表达;经IHC实验检测发现,完全缓解及部分缓解组的NF-κB均为低表达,而疾病进展组NF-κB表达升高,结果与SREBP1的趋势为一致。3.干毫NF-κB通路能逆转SREBP1过表达引起的孕激素耐药恶性生物学行为:在过表达SREBP1及对照组细胞系中瞬时转染NF-κB小干扰以敲低NF-κB的表达,继续进行MTT、凋亡等实验,结果显示敲低NF-κB能改善细胞SREBP1过表达引起的孕激素的敏感性的下降,逆转SREBP1过表达诱导的孕激素抵抗。研究结论1.SREBP1促进NF-κB的核移位激活NF-κB通路,进而诱导子宫内膜样腺癌孕激素抵抗的发生。2.干扰NF-κB通路能逆转SREBP1过表达引起的细胞系对孕激素敏感性降低的生物学行为,逆转子宫内膜样腺癌的孕激素抵抗。