第一部分COL4A1突变导致遗传性脑小血管病PADMAL的研究研究背景常染色体显性遗传微血管病变伴桥脑及脑白质病变(Pontine autosomal dominant microangiopathy and leukoencephalopathy,PADMAL)是一类 COL4A13’端非转录区突变引起的脑小血管病。PADMAL的遗传特质与其他脑小血管病如常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病(Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)、脑视网膜血管病变(Retinal vasculopathy with cerebral leukodystrophy,RVCL)完全不同,作为COL4A1相关脑小血管病,PADMAL与COL4A1转录区突变所致疾病的表现也不相同,但其与瑞典遗传性多发性梗死性痴呆(hereditary multi-infarct dementia,hMID)在临床表现及遗传基因方面有较多相似性。PADMAL的临床诊断主要依赖于核磁共振(MRI)中桥脑更易受累,而颞叶受累罕见。与CADASIL相比,PADMAL患者颅内微出血较少见。研究目的1、鉴定一中国PADMAL家系的致病基因。2、比较PADMAL与瑞典hMID疾病临床特点、遗传因素的异同。研究方法1、对家系患者进行病史采集及神经系统查体。2、采集家系成员外周血后提取DNA,对患者DNA行全外显子组测序,Sanger测序验证可能的致病基因。3、对家系患者行颅脑及颈髓核磁共振扫描。4、对患者行皮肤活检并用电镜观察血管病理改变。研究结果1、家系患者于40岁左右时起病,临床表现以急性脑梗死引起的肢体无力及进行性痴呆为主。2、全外显子组测序提示家系患者COL4A1 3’端非转录区的一处杂合突变(c.*32G>A)。Sanger测序验证该突变位点在家系成员中共分离。3、家系患者颅脑及颈髓核磁共振成像中可见双侧脑白质病变及桥脑、颈髓腔隙性梗死灶。4、皮肤活检电镜中可见血管内皮细胞与平滑肌细胞之间有纤维沉积,皮肤小血管管腔变窄。结论1、报道中国人群中第一例常染色体显性遗传微血管病变伴桥脑及脑白质病变(PADMAL),家系患者致病基因为COL4A1(c.*32G>A)。2、新发现家系患者颈髓病变,根据家系患者的临床特点、影像学表现、病理改变及致病基因,将PADMAL与瑞典hMID归类于同一疾病。第二部分SMEK1通过影响微管稳定性导致神经退行性病变的机制研究研究背景蛋白磷酸酶4(Protein phosphatase 4,PP4)是一种广泛表达于各组织器官中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。PP4参与了细胞中生物过程及信号通路,其中包括核转录因子κB(NF-κB)信号通路、氨基末端激酶(JNK)信号通路、凋亡传导通路、胰岛素受体底物4(IRS4)及雷帕霉素机制靶点(mTOR)通路。作为催化酶复合体,PP4包含催化亚基PP4C和调节亚基PPP4R3A(Protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A,SMEK1)和 PPP4R3B(Protein phosphatase 4 regulatory subunit 3B,SMEK2)。PPP4R3A又名 SMEk1(Suppressor Of mitogen-activated protein kinase 1 null)编码保守表达的 Smek1 蛋白,广泛存在于神经系统中,其主要定位于细胞核内、核周及细胞骨架处。根据细胞所处的分裂周期,Smek1的亚细胞定位会发生相应改变,在分裂间期、前期时Smek1大多定位于细胞核内,而前中期至后期时进入细胞质中,这与Smek1的核定位功能域相关。研究表明Smek1在神经发生中起重要作用。在神经前体细胞及神经干细胞中,Smek1可以通过Mbd3、Par3和Ryk调节神经细胞的分化和增殖,从而影响神经发生。为了进一步研究SMEK1在成年小鼠神经系统中的作用,本研究通过构建Smek1 flox/flox C57BL/6小鼠,利用Cre-LoxP重组酶系统将SMEK1全身敲除,探讨SMEK1在神经系统尤其是神经退行性改变中的潜在分子机制。研究方法1、探究Smek1在神经系统中的表达特性(1)利用公共数据库数据分析SMEK1在神经系统中的表达模式。(2)确定小鼠特定脑区中Smek1的表达情况及亚细胞定位。2、构建Smek1敲除小鼠(1)构建基因打靶所需的载体:通过同源重组在SMEK1线性化载体的第二外显子两端插入loxP位点,同时引入Neo标签以便筛选;(2)重组载体通过电转技术导入胚胎干细胞,经过药物筛选、PCR扩增、Southern blot筛选同源重组的胚胎干细胞;(3)制备嵌合型小鼠:将含目的质粒的胚胎干细胞通过显微注射入囊胚中,经注射的囊胚在假孕母鼠的子宫中生长得到嵌合型小鼠;(4)获得杂合突变小鼠:将杂合突变的嵌合型小鼠与野生型C57BL/6交配,利用PCR技术鉴定子代小鼠基因型得到F1代杂合突变小鼠;(5)获得纯合突变小鼠:将F1代杂合突变小鼠互交,获得F2代Smek1 flox/flox小鼠;(6)获得全身敲除小鼠:将Smek1 flox/flox小鼠与Sox2-Cre C57BL/6小鼠杂交,获得F1代Smek1-/+全身敲除杂合小鼠,将F1代杂合突变小鼠互交,获得F2代小鼠;(7)获得C57BL/6-1CR混合遗传背景敲除小鼠:将F1代Smek1-/+小鼠与野生型ICR小鼠交配,取子代小鼠中Smek1-/+小鼠互交得到混合背景的野生、杂合及纯合敲除小鼠。3、Smek1敲除小鼠的表型观察及行为学研究(1)观察并记录小鼠的出生率及生存期,记录第4-12周小鼠体重;(2)记录小鼠运动行为及认知行为:后肢抱握、转棒试验、跑台试验、旷场试验、T型水迷宫及筑巢试验。4、Smek1敲除小鼠神经系统病理改变(1)取2月龄小鼠脑切片行尼氏染色;(2)取12月龄小鼠脑、脊髓切片行NeuN、GFAP、MBP免疫荧光染色、BDNF免疫组化染色、尼氏染色及Bielschowsky银染;(3)12月龄小鼠腓肠肌肌肉H&E染色。5、敲除SMEK1后对微管稳定性的影响(1)构建敲低SMEK1、过表达SMEK1的SH-SY5Y稳筛细胞系;(2)利用Smek1与微管标志蛋白共染,显示Smek1在坐骨神经和SH-SY5Y细胞系中的定位;(3)取12月龄小鼠坐骨神经及视神经行电镜检测;(4)利用SH-SY5Y细胞系验证Smek1缺失对微管的影响。6、Smek1通过调控Kif2a及Tau影响神经退行性病变的机制(1)Co-IP和Duolink实验验证Smek1与Kif2a的相互作用;(2)利用质核分离手段鉴定Kif2a的亚细胞定位特征;(3)免疫荧光检测Kif2a在脑组织中的表达情况;(4)利用Western blot检测稳筛细胞系PI3K-AKT信号通路变化。7、SMEK1减少引发线粒体运输异常及细胞凋亡(1)利用mitoTracker显示线粒体在SH-SY5Y稳筛细胞系中的定位;(2)电镜显示坐骨神经中的线粒体与微管的关系;(3)小鼠肌肉组织NADH染色;(4)利用CCK8检测细胞的增殖情况及线粒体活性;(5)TUNEL染色显示老年鼠脑组织凋亡情况;(6)PI染色检测稳筛细胞系的凋亡水平。实验结果1、SMEK1广泛表达于中枢神经系统SMEK1在大脑的海马、皮层、黑质、纹状体等多个脑区中有较高的表达量。相比于青年人,老年人的前额皮层及海马组织中SMEK1的表达量降低。2、SMEK1缺失影响小鼠的胚胎、幼鼠的发育及衰老过程C57BL/6 SMEK1-/+小鼠自交后,共获得353只子代小鼠,其中纯合小鼠仅有15只;C57BL/6与ICR混合遗传背景的SMEK1-/+自交后得到90只小鼠,其中纯合小鼠9只,以上2种交配方案得到的子代数目均不符合孟德尔分离率,这提示敲除SMEK1后可导致大部分胚胎死亡。C57BL/6纯合小鼠体重轻,生存期短,杂合及纯合子从6月龄开始出现运动能力下降,纯合小鼠的运动障碍较杂合小鼠更为明显,并随着年龄增长下降而加重。同时小鼠在6月龄以后出现轻度的认知功能下降。3、SMEK1缺失可导致神经系统退行性改变12月龄Smek1敲除小鼠的海马及运动皮层、脊髓前角存在神经元丢失及星形胶质细胞激活。SMEK1减少时星形胶质细胞合成脑神经营养因子减少。腓肠肌肌肉染色提示失神经改变,脑和脊髓中未见明显的脱髓鞘。4、SMEK1缺失时神经元轴突微管稳定性下降Smek1在坐骨神经及神经母细胞瘤细胞系中与微管共定位。Smek1敲除鼠的脑组织中神经纤维减少,小鼠坐骨神经及视神经的微管明显减少,同时在敲低SMEK1的稳筛细胞系中细胞骨架和微管稀疏,而过表达SMEK1时相应蛋白表达增多。5、Smek1通过调控Kif2a及Tau影响神经退行性病变的机制Kif2a可通过微管解聚使神经元的轴突变短,Smek1与Kif2a在细胞核和细胞质中均存在相互结合,且Smek1敲低时Kif2a入核减少,在Smek1表达减少时,影响微管稳定性的Tau蛋白磷酸化水平增加,而其上游的PI3K-AKT通路也相应改变。6、SMEK1维持了微管稳定性、线粒体运输和功能、神经元的存活坐骨神经电镜显示纯合敲除小鼠线粒体的运输存在异常,在SH-SY5Y稳筛细胞系中发现SMEK1敲低时线粒体主要定位于胞核周围,而高表达时线粒体可运输至细胞突起远端。同时SH-SY5Y稳筛细胞系线粒体膜电位下降,CCK8检测示线粒体功能下降。TUNEL染色显示敲除小鼠脑组织中有凋亡信号,稳筛细胞系的PI染色显示敲低SMEK1时凋亡细胞增多。结论1、SMEK1缺失可加速小鼠神经系统衰老,表现为运动及认知执行能力下降。2、SMEK1通过影响神经微管的稳定性,进而影响线粒体的微管运输及功能。3、Smek1敲除小鼠中枢内提前出现神经元丢失、轴突减少和胶质增生,周围神经中可见神经纤维内微管破坏增多。第三部分SMEK1缺失诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎加重的机制研究研究背景实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一种主要由CD4+辅助T细胞介导的、累及中枢神经系统的炎性脱髓鞘性疾病,是目前公认的研究人类多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)的理想动物模型。通过免疫同种抗原可以在易感动物中成功地诱导发生。小胶质细胞作为中枢神经系统的炎性细胞在EAE和MS中发挥重要作用。小胶质细胞激活后分泌炎症因子如IL-1β可引起颅内病变,同时星形胶质细胞活化后一方面可以参与到炎症反应中,另一方面,星形胶质细胞的异常可引起血脑屏障通透性增加,进一步加重神经炎症。干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)作为Th1分泌的主要细胞因子在EAE/MS的发病过程中扮演着多重角色。研究表明在EAE动物模型及多发性硬化患者中注射干扰素γ和抗干扰素γ的抗体均可加重疾病表型。此外,将干扰素γ修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)注射入EAE动物模型体内后可通过调节吲哚胺-2,3-加双氧酶1(Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1,IDO1)降低疾病评分。在EAE的发病过程中,DC可通过参与抗原递呈而发挥免疫调节作用。芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)在激活后可以诱导DC免疫耐受从而抑制EAE的致病性。已有文章表明PP4参与消化系统免疫调控过程,而SMEK1作为PP4的调节亚基在自身免疫病中的作用尚无报道,目前已知Smek1广泛表达于外周血中多种免疫细胞,同时,Smek1参与了胚胎时期神经发生等重要过程。因此本研究通过中枢神经系统自身免疫动物模型以探究SMEK1在中枢神经免疫和炎症中的作用和机制。研究目的1、探究Smek1敲除对EAE临床表现及组织病理改变。2、研究Smek1在小鼠免疫系统及中枢神经系统炎症中的作用机制。研究方法1、利用GEO数据库分析Smek1在多发性硬化患者外周血及脑组织的表达情况。取6-8周龄Smek1杂合敲除鼠及同窝野生型雌鼠皮下注射MOG35-55乳化液诱导EAE模型,同时腹腔注射200 ng-300 ng PTX,免疫当日计为第0天,48小时后再次腹腔注射等量PTX。每日记录免疫小鼠的体重并进行临床评分。2、在EAE小鼠发病达到最高峰时将小鼠处死,取小鼠脊髓颈膨大节段并保存于组织固定液,石蜡包埋,连续切片,行H&E、免疫组化染色显示小鼠炎性细胞浸润情况。3、取EAE小鼠脾脏及腹股沟、腋窝淋巴结制备成单细胞悬液,根据检测目的,加入CD11c、CD80、CD86、MHC-II检测DC,或将细胞种至培养皿中刺激阻断后分别加入CD4、IFN-y抗体检测Th1细胞,加入CD4、IL-4、IL-10检测Th2,加入F4/80、IL-1β检测巨噬细胞。4、取6-8周雌鼠的脾脏,在1640培养基中分别加入anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ及LPS体外诱导分化,实时荧光PCR及Western blot检测细胞因子转录水平的改变及相关通路的变化。5、对EAE小鼠脊髓切片行免疫荧光及免疫组化染色,显示中枢神经系统内胶质细胞的激活及MMP9的沉积,向小鼠注射荧光素钠检测EAE免疫小鼠血脑屏障通透性。利用小胶质细胞系及EAE小鼠脊髓切片行AhR免疫荧光染色。6、取疾病高峰期小鼠的脑组织提取mRNA及蛋白。将mRNA逆转录为cDNA后行实时荧光PCR。蛋白提取后定量、Western blot检测相应指标。同时,取EAE小鼠血清及脑组织,用ELISA法测定外周血中IL-1β水平。7、单细胞测序结果分析敲除Smek1后小鼠脑组织内小胶质细胞的转录表达模式。研究结果1、Smek1缺失可导致多发性硬化及EAE小鼠临床症状加重在多发性硬化患者的外周血及脑组织中SMEK1表达水平降低,Smek1杂合敲除小鼠在EAE中临床表现更为严重。2、敲除Smek1抑制IFN-γ而促进巨噬细胞的活化在EAE小鼠中,Smek1杂合敲除鼠的脊髓炎性细胞浸润增多,然而CD4阳性细胞较少,IBA1阳性细胞占浸润细胞的主要部分。流式细胞术检测实验性自身免疫性脑炎小鼠脾脏和淋巴结中的单个核细胞发现IFN-y减少而IL-1β增多。3、Smek1杂合敲除鼠中枢神经系统中胶质细胞激活在Smek1杂合敲除的EAE小鼠中,星形胶质细胞和小胶质细胞激活,并分泌大量IL-1β。同时中枢神经系统内NF-kappaB通路激活,血脑屏障通透性增高。4、单细胞测序发现Smek1敲除鼠存在新的小胶质细胞亚群我们在小鼠皮质、海马的单细胞测序结果中发现Smek1敲除鼠存在两群表达模式完全不同的小胶质细胞,其中一群小胶质细胞高表达炎性分子,进一步分析发现该群小胶质细胞是由异常分化形成的。5、Smek1杂合敲除鼠通过减少IFN-γ的分泌抑制了小胶质细胞及淋巴细胞内的犬尿酸-芳香烃受体通路在Smek1杂合敲除鼠的脾脏中的免疫细胞和中枢神经系统内的小胶质细胞中芳香烃受体及其上游的吲哚胺-2,3-加双氧酶的处于抑制状态,同时在转录水平下调抑炎因子IL-10,从而加重敲除鼠中的临床表型。体外分离小鼠脾脏细胞并加入anti-CD3、anti-CD28刺激培养,Smek1杂合敲除小鼠脾脏细胞IFN-y及IL-10 mRNA水平降低。结论1、SMEK1敲除后小鼠髓系巨噬细胞IL-1β表达增多,免疫后巨噬细胞激活增多。2、SMEK1敲除小鼠脑内存在一群新分化小胶质细胞发挥促炎作用。3、SMEK1敲除EAE小鼠中,IFN-γ分泌减少,导致免疫抑制通路IDO1-AhR受损。