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鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)是小鹅瘟的病原,可引起4～20日龄雏鹅的急性或亚急性败血性感染,也能感染雏番鸭。其传播速度快,发病率、死亡率都很高,给养鹅业带来重大的经济损失。所以本试验旨在建立一种快速、特异、准确的诊断GPV的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR, FQ-PCR)方法,并用该方法对病毒在雏鹅体内分布规律进行了较系统的研究,为指导临床诊断样品的采集保证诊断的可靠性与准确性和对该病的诊断监测提供了重要的试验数据和理论依据。此外,还分别将来自国内的4个GPV毒株,通过PCR技术从病毒基因组DNA中扩增出病毒VP3完整基因片段进行克隆及序列比较,为鹅细小病毒感染的预防和疫苗的选择提供了一定的理论依据。本研究共分四部分:一、GPV山东株的分离鉴定采取山东某鹅场发病典型的商品代鹅和本实验室保存2002年病料的心脏、肝脏、肠道等组织脏器,制成乳剂,接种于12日龄鹅胚尿囊腔,结果接种后72～192 h内,鹅胚死亡,死亡率95%,且鹅胚呈出血状;接种3日龄雏鹅,结果表明试验组雏鹅能够表现出小鹅瘟临床症状,而对照组正常;琼脂扩散试验结果显示与鹅细小病毒标准株阳性血清有明显沉淀线;参照GenBank GPV标准株B株结构蛋白VP1基因序列设计一对特异性引物,PCR反应扩增获得目的条带,克隆测序后,与GPV B株序列同源性达98%。综合以上生物学和分子生物学的实验结果,可确定分离到2株GPV,并命名为SD2002株和SD2005株。二、LUXTM引物荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR FQ-PCR)检测GPV方法的建立根据国际GeneBank 1995年发布的鹅细小病毒(GPV) B株的全基因组序列,针对GPV的保守基因片段VP1设计一对LUXTM引物,建立了一种用于检测GPV的特异的FQ-PCR方法,该法能够特异地扩增出预期大小约为62bp特征性片段。特异性实验证明,该法对鸭瘟病毒(DPV)、雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)和正常鹅胚尿囊液及鹅组织DNA均呈阴性反应;灵敏性实验证明,该方法能够检出GPV基因质粒达103个拷贝数,检测到的GPV病毒核酸最低量可以达到2.5pg。三、荧光定量PCR检测雏鹅人工感染GPV后病毒在体内分布规律用建立的FQ-PCR检测鹅细小病毒的方法,检测3日龄GPV抗体阴性雏鹅经口服加滴鼻的方法人工感染GPV后,各器官不同时间段的病毒含量。结果表明:在攻毒8h后能从舌、各个肠段、粪、消化系统、血液、心脏和肝脏中检测到病毒DNA;病毒DNA的含量在48h后达到最高峰并一直维持到168h,这段时间在每个待检脏器中均能检测到大量病毒DNA;随后各待检脏器中病毒DNA含量持续降低,但在720h后仍能从粪、肝脏和脾中检测到少量的病毒DNA。本研究为指导临床诊断样品的采集保证诊断的可靠性和准确性以及对该病的诊断监测提供了重要的试验数据和理论依据。四、GPV不同毒株主要结构蛋白VP3基因的序列比较分析根据发表的GPV B株基因序列合成了扩增GPV VP3基因的一对特异性引物。利用这对引物,分别将来自国内的4个GPV毒株,通过PCR技术从病毒基因组DNA中扩增出病毒VP3完整基因片段,将其克隆、鉴定、测序。序列测定结果显示4个GPV毒株的VP3基因全长均为1605bp,编码534个氨基酸。氨基酸序列分析比较表明:4株GPV VP3基因氨基酸编码序列非常保守,与其它参考毒株的同源性在96.4%～99.8%之间,其中,2株山东株之间的同源性为99.3%,与其它参考毒株的同源性在97.1%～99.3%。进化树分析比较表明:2株山东株与包括台湾株在内的中国株GPV亲缘性较近,与欧洲株(匈牙利株和德国株)亲缘性较远。序列比较还表明,疫苗株VP3基因氨基酸序列并没有其独有的氨基酸突变位点。