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第一部分c-Jun氨基末端激酶通路在大鼠缺血再灌注脑损伤中作用的研究目的观察磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)在大鼠缺血再灌注损伤脑组织中的变化规律,探讨其抑制剂SP600125对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用。方法1.采用改良Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。实验动物随机分为对照组、缺血再灌注(IR)组、缺血再灌注+二甲亚砜(IR+DMSO)组、缺血再灌注+DMSO+SP600125干预(IR+SP)组。IR+DMSO组及IR+SP组随机分为缺血2h再灌注6、12、24、72 h组。2.采用TTC染色观察脑梗死体积,HE染色观察缺血坏死神经元改变。3.采用免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组活化的c-Jun氨基末端激酶p-JNK,观察p-JNK在缺血再灌注脑组织不同时程的变化规律。4.观察p-JNK抑制剂SP600125对p-JNK表达的影响。结果1.线栓法制备缺血再灌注模型成功率为75.6%; TTC染色可见大脑中动脉供血区梗死灶；HE染色可见梗死区神经元缺血坏死改变。2. p-JNK免疫组化研究显示：对照组大鼠神经元、神经胶质细胞棕褐色染色阴性。IR+DMSO组再灌注6h神经元、神经胶质细胞胞核呈棕褐色染色；再灌注12h,胞核浓染,阳性细胞数增多；再灌注24h阳性细胞数减少；至72h阳性表达仍持续较高水平。SP600125干预组大鼠神经元、神经胶质细胞核为浅或中等程度棕黄色颗粒沉积,阳性细胞数较IR+DMSO组减少(P<0.05)。3. Western blot研究发现,再灌注6h脑组织p-JNK表达升高,在12 h达高峰,24h表达略下降,72h仍有较高表达。SP600125干预组较IR组及IR+DMSO组大鼠脑组织p-JNK表达显著降低(P<0.01),高峰不明显(P>0.05)。结论1.线栓法致大鼠脑组织缺血再灌注损伤后神经元、神经胶质细胞表现为坏死样形态改变。2. p-JNK的活性在脑损伤时表现出时间依赖性增高,该变化可被SP600125抑制。3. SP600125可减轻缺血再灌注造成的神经元损伤。第二部分内质网通路在大鼠缺血再灌注脑损伤中的作用及p-JNK抑制剂的影响目的观察内质网通路中的凋亡相关蛋白GADD153、caspase-12在大鼠缺血再灌注脑损伤不同时程的变化规律,并探讨p-JNK抑制剂SP600125对二者表达的影响。方法1.建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,实验动物随机分为对照组、缺血再灌注(IR)组、缺血再灌注+二甲亚砜(IR+DMSO)组、缺血再灌注+DMSO+SP600125干预(IR+SP)组。IR+DMSO组及IR+SP组随机分为缺血2h再灌注6、12、24、72 h组。2.采用免疫组化、Western blot及免疫荧光双标法检测缺血再灌注不同时间点GADD153、caspase-12的变化。结果1.免疫组化和免疫荧光双标检测显示脑缺血再灌注后皮层和纹状体区GADD153表达均增高,神经元及神经胶质细胞胞核、胞浆呈棕褐色染色,阳性细胞主要位于纹状体区,皮层表达较少,P<0.05; Western blot结果显示再灌注6hGADD153表达增加,持续至72h仍明显增高,P<0.05。2.应用SP600125干预后,与DMSO组比较,再灌注6、12h GADD153的表达变化不明显(P) 0.05),24、72h GADD153的表达明显下降(P<0.05)3.免疫组化和免疫荧光双标检测显示脑缺血再灌注后皮层和纹状体区caspase-12表达均增高,神经元及神经胶质细胞胞浆呈棕褐色染色,而纹状体caspase-12表达明显高于皮层(P<0.05); Western blot结果显示再灌注6hcaspase-12表达增加,逐渐增高,至24达高峰(P<0.01),72h仍维持在较高水平。4.应用SP600125干预后,caspase-12在缺血再灌注脑组织的表达明显低于无SP600125干预组(P<0.05),高峰期不明显(P>0.05)。5.DMSO组免疫荧光双标染色显示,再灌注6h可见GADD153、caspase-12单标及双标阳性细胞,主要位于纹状体区；12-24h二者单标及双标阳性细胞数均明显增多(P<0.05),主要位于纹状体区,皮层区也可见少量表达；至72h,GADD153单标阳性细胞数减少,caspase-12单标阳性细胞数仍较多,双标阳性细胞数减少(P<0.05)。6.与DMSO组比较,SP组GADD153单标阳性细胞数略有减少,caspase-12单标阳性细胞数及双标阳性细胞数明显减少(P<0.05)。结论1. GADD153和caspase-12在缺血再灌注脑组织中的表达增加,内质网应激参与了缺血再灌注脑损伤的病理过程。2.缺血再灌注脑损伤时,c-Jun氨基末端激酶通路可能通过激活caspase-12途径参与了内质网应激反应过程。