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褪黑素（Melatonin）是一种在松果体中产生的激素,在昼夜节律的调节中起着关键作用。近年来研究表明,褪黑素参与体内诸多生理过程的调控。棕色脂肪组织（Brown Adipose Tissues,BAT）是哺乳动物体内的产热组织,活化后的BAT可有效提高哺乳动物的能量代谢能力。BAT的产热主要通过解偶联蛋白-1（Uncoupling Protein 1,UCP-1）解偶联实现,该蛋白可将线粒体中的ATP能量解耦,产生热量,进而调节体温。研究表明,12小时内的初生羔羊通过BAT产生的热量是抵御环境冷刺激的关键,而BAT发育缺陷或产热能力低下是造成冬春季节初生羔羊高死亡率的主要原因。发育生物学研究表明,绵羊在胚胎发育后期即形成功能完整的BAT。阐明其发育机制,通过调控胚胎期BAT的发育、增强其产热功能对提高冬春季节羔羊成活率有重要意义。试验选取120天胎羊6只,分离出肾周棕色脂肪组织,并分离棕色脂肪前体细胞。研究了褪黑素（1 n M,10 n M）对棕色脂肪前体细胞体外增殖及分化的调控。试验采用Edu（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）染色观察褪黑素对绵羊棕色脂肪前体细胞DNA合成的影响,通过划痕试验检测其对绵羊棕色脂肪前体细胞迁移的影响,通过Western blotting检测了增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶4（Cyclin-dependent kinases 4,CDK4）三个周期蛋白的表达。通过油红O染色检测褪黑素对绵羊棕色脂肪前体细胞脂滴沉积的影响,通过免疫荧光阐明不同浓度的褪黑素对UCPI蛋白表达的影响,通过q RT-PCR,Western blotting等检测褪黑素对分化过程中特异性基因和蛋白表达的影响。利用CRISPR/Cas9技术敲除AMPKα1基因,观察敲除AMPKα1后对分化的影响,以及褪黑素是否通过影响AMPKα1调控绵羊棕色脂肪前体细胞分化。全文结论如下:1、褪黑素抑制绵羊棕色脂肪前体细胞的体外增殖能力。1 n M及10 n M的褪黑激素可显著抑制绵羊棕色脂肪前体细胞的增殖能力,DNA的合成减缓。同时,PCNA（P＜0.05）,Cyclin D1（P＜0.01）,CDK4（P＜0.05）等细胞周期蛋白的表达显著降低。2、褪黑素有效促进绵羊棕色前体细胞分化能力。褪黑激素可有效提高细胞的棕脂分化潜能,促进成熟棕色脂肪的形成。棕色脂肪特异性蛋白,包括UCP1、含有16位的PR结构域基因（PR domain containing 16,PRDM16）、过氧化物酶体增生物激活受体γ（Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ）等的表达增加（P＜0.05）。UCP1、PRDM16、PPARγ、细胞色素复合物（Cytochrome C）、细胞色素C氧化酶多肽7A（Cytochrome c oxidase polypeptide 7A,Cox7a）、细胞死亡激活剂（Cell death activator,Cidea）等产热基因上调（P＜0.05）,供能和产热显著增加。3、褪黑素激活了前体细胞内的AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPKα1）、乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-Co A Carboxylase,ACC）。棕色脂肪细胞中的p-AMPKα1、p-ACC蛋白表达显著升高（P＜0.05）。4、AMPKα1调控前体细胞的分化能力。敲除绵羊棕色脂肪前体细胞的AMPKα1基因,检测到p-ACC,PRDM16,CCAAT/增强子结合蛋白β（CCAAT/enhancer-binding protein beta,C/EBPβ）,细胞色素C氧化还原酶（Cytochrome c–oxidoreductase,Complex III）,ATP合酶（ATP synthase,Complex V）蛋白表达降低（P＜0.05）,UCP1蛋白表达显著减少（P＜0.05）,成熟脂肪细胞数量减少（P＜0.05）。二甲双胍（Metformin）激活绵羊棕色脂肪前体细胞AMPKα1后,p-AMPK,p-ACC,PRDM16,C/EBPβ,Complex III,Complex V蛋白含量显著增加（P＜0.05）,UCP1蛋白表达显著增加（P＜0.05）,成熟脂肪细胞数量显著增加。5、褪黑素通过AMPKα1影响绵羊棕色脂肪前体细胞分化。敲除AMPKα1基因后,经过褪黑素处理,p-AMPK,p-ACC,PRDM16,C/EBPβ,Complex III,Complex V蛋白表达不能恢复到正常水平（P＜0.05）,证明褪黑素能通过调控AMPKα1基因,进而调控BAT特异性基因和产热基因的表达,调控产热。综上,本研究阐明了褪黑素可抑制绵羊棕色前体细胞增殖,并通过激活AMPKα1促进其成脂分化,研究结果可为理解羔羊BAT发育提供科学依据。