酶催化在生物技术制药行业中因其环境友好型特征受到了与日俱增的关注度,然而酶催化受到其本身性质的影响,在催化过程中极易受到外界因素影响而失去活性,且游离酶难以回收而造成分离困难和成本居高不下。而固定化酶因其环境耐受性较强和分离便捷等优势,可以较好地克服游离酶的诸多问题。本论文为了探索抗癌药物克唑替尼中间体(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇的酶促手性合成方法,将醛酮还原酶和醇脱氢酶共同固定化于载体中,并用于手性催化以实现目标产物合成的绿色环保和节能高效。分别用环氧树脂和无机盐磷酸钙做为载体,研究其中的醛酮还原酶和醇脱氢酶固定化过程和结果,分别考察了二种固定化方法制得的固定化酶催化性能,且利用制得的固定化酶批次循环催化合成克唑替尼中间体(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇,并比较二个代表性的有机载体和无机载体固定化酶的性能。我们使用了扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱、X射线衍射仪等仪器对双酶@磷酸钙纳米花(hNFs)进行了表征。首先,通过大肠杆菌外源基因的表达合成醛酮还原酶(AKR)和乙醇脱氢酶(ADH),对蛋白表达条件进行优化,最终确定AKR的表达温度为23℃,转速为220 rpm,加入的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mM,诱导时间为15 h;ADH的最佳表达条件为18℃,220 rpm和终浓度为0.5 mM的IPTG。在经过镍柱纯化后获得一定数量的双酶,对双酶耦合催化反应进行构建,在最佳条件游离酶能够达到40%的转化率和远远大于99.98%的对映体选择性(ee值)。但至此为止本论文研究发现,ADH和AKR游离酶热稳定性极差,即使是在催化效率较低的30℃环境下,在8 h内ADH和AKR失去其一半的活性,在60℃高温环境,几乎丧失全部活力。液相分析结果显示未见目标产物生成。其次,通过将环氧树脂与游离酶的固定化,我们能够得到一批具有一定热稳定性和循环催化能力的环氧树脂固定化酶。酶活回收率能达到80%以上,在60℃恒温8 h后,环氧树脂固定化酶依旧保持了初始活性的50%而游离酶基本丧失全部酶活。循环催化结果显示环氧树脂固定化酶能够在5个催化循环内保证70%以上的催化效率。然而,环氧树脂固定化酶在第6个催化循环产率下降为58%,稳定性较为欠缺,这可能与环氧树脂载体作为有机高分子载体的属性以及酶与载体共价连接的随机性有关。鉴于此,本文基于生物矿化理论,采用无机磷酸盐与酶蛋白共结晶以制得双酶@磷酸钙纳米花,从而实现无机载体中的酶固定化。以此法固定化酮还原酶(AKR)和醇脱氢酶(ADH)后,二者活性皆有着显著的提升,与AKR和ADH的游离酶酶活相比,纳米花固定化酶中比活力(U/mg)分别提升了3.3倍和2.1倍。此外,固定化酶的热稳定性也得到显着提高:在60℃下孵育8小时后,双酶@磷酸钙纳米花中的两种酶剩余活力超过初始活性的80%,而时游离酶基本上丧失全部酶活。使用X射线衍射仪对纳米花进行分析,发现其主体结构为羟基磷灰石及其衍生物。使用傅里叶红外光谱对纳米花进行分析,发现酶在固定化前后代表着活性中心的酰胺I带和II带没有变化,意味着酶的结构基本没有发生变化。最终我们使用扫面电子显微镜纳米花进行分析,确认其尺寸和结构与之前报导结构相似。因此本文研究认为双酶@磷酸钙纳米花的固定化方法卓有成效。最后,本文重点对双酶@磷酸钙纳米花的催化性能进行了进一步的探究。结果发现,当AKR和ADH在纳米花中的固定化比例为3:1时,对于合成手性乙醇具有最高的催化活性,催化产率高达90.8%,最终产物(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇的ee值高于99.98%的ee值。且纳米花固定化酶的批次催化实验证明,16个循环周期(12 h一个循环)内基本保持其全部的初始活性,这为后期计划的放大实验奠定了较好的基础。总之,本文在ADH和AKR双酶游离酶成功耦合催化合成(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇的基础上,将环氧树脂固定化法和双酶@磷酸钙纳米花固定化法引入到固定化过程中,两种方法均使得酶蛋白的稳定性有着显著的提高,其中后者优势更加明显。高活性、高稳定性及高环境耐受性的双酶@磷酸钙纳米花在目标手性中间体的催化合成中有望缓解化学合成的高污染以及游离酶催化的高成本等问题。同时,环氧树脂固定化法和双酶@磷酸钙纳米花的固定化方法的对照和比较可进一步丰富酶固定化和催化的理论与应用研究。